Nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katG và gen inhA từ các chủng vi khuẩn lao phân lập tại Miền Trung - Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

_____________ ______________

TRỊNH QUỐC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC

ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN

KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP

TẠI MIỀN TRUNG – VIỆT NAM

LUẬ N VĂN THẠ C SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌ C

Thái Nguyên – 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

_____________ ______________

TRỊNH QUỐC PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC

ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN

KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP

TẠI MIỀN TRUNG – VIỆT NAM

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số : 60.42.80

LUẬ N VĂN THẠ C SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌ C

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh

Thái Nguyên – 2011

Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Bệnh lao là bệnh truyền nhiễm do vi trùng lao (còn gọi là vi trùng Koch hay

BK) gây ra, có thể lây nhiễm từ ngƣời bệnh sang ngƣời lành. Bệnh có thể gặp ở tất

cả các bộ phận của cơ thể, trong đó lao phổi là thể lao phổ biến nhất (chiếm 80 -

85%) và là nguồn lây chính cho ngƣời xung quanh, nhƣng nó cũng dễ ảnh hƣởng

đến hệ thần kinh trung ƣơng dẫn đến bệnh lao màng não, ảnh hƣởng hệ bạch huyết,

hệ tuần hoàn dẫn đến bệnh lao kê.

Bệnh có thể chữa khỏi mà không để lại di chứng nếu nhƣ đƣợc phát hiện sớm,

điều trị kịp thời. Tuy nhiên, nếu ngƣời bệnh điều trị không đúng cách (bỏ dở điều trị

hoặc dùng thuốc không đúng theo chỉ dẫn của thầy thuốc) sẽ gây hậu quả nghiêm

trọng nhƣ: Bệnh không khỏi, dễ để lại di chứng hoặc gây tử vong; gây ra hiện tƣợng

kháng thuốc, nguy hiểm nhất là kháng đa thuốc làm cho việc điều trị càng khó khăn

và tốn kém hơn; tiếp tục là nguồn lây nhiễm trong cộng đồng.

Việc điều trị lao đa kháng thuốc rất phức tạp và khó khăn. Chi phí điều trị

cao, thời gian điều trị kéo dài. Tỷ lệ khỏi bệnh thấp, tỷ lệ bỏ trị và tử vong của bệnh

nhân cao.

Hiện nay, để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc các cơ sở y tế trong nƣớc

vẫn phải dựa vào phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn lao và làm kháng sinh đồ kéo dài

ít nhất 4 - 6 tuần nhƣ vậy sẽ gặp khó khăn trong việc điều trị.

Sinh học phân tử đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao

kháng thuốc và khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên. Thời gian chẩn đoán có thể

rút ngắn xuống còn vài ngày với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

Kháng thuốc là do xảy ra đột biến trong các khu vực của hệ gen MTB, nhƣ:

katG, inhA, ahpC, kasA và ndh liên quan đến tính kháng isoniazid (INH), ropB

kháng rifampicin (RIF), embB kháng ethambutol (EMB), pncA kháng pyzamid

(PZA) và rpsL, rrs liên quan đến tính kháng streptomycin (STR).

Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

"Nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định

đột biến trên gen katG và gen inhA từ các chủng vi khuẩn lao phân lập tại Miền

Trung - Việt Nam ".

2. Mục tiêu nghiên cứu

Phát hiện đột biến trên gen katG và gen inhA liên quan đến tính kháng isoniazid

ở các chủng lao nghiên cứu.

3. Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết DNA tổng số từ mẫu đờm của các bệnh nhân

- Kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số bằng đo OD260nm / 280nm = 1,8 -

2,2

- Nhân bản đoạn gen katG và gen inhA từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu

- Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli

- Tách dòng gen katG và gen inhA

- Giải trình tự gen katG và gen inhA

- Phát hiện, phân tích đột biến trên gen katG và gen inhA liên quan đến tính

kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu.

Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3

Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀI LIỆ U

1.1 Tình hình bệnh lao

1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới

Nhƣ chúng ta đã biết , lao là mộ t trong nhƣ̃ng bệnh nhiễm trùng mãn tính

xuất hiện sớm nhất ở loài ngƣời và có khả năng lây truyền trong cộ ng đồng , là mối

đe dọa lớn với tất cả mọi ngƣời trên hành tinh này . Nếu không có sƣ̣ kiểm soát củ a

con ngƣời bằng nhƣ̃ng phƣơng pháp và công cụ hƣ̃u hiệu, bệnh lao có thể bùng phát

nhƣ mộ t bệnh dịch nguy hiểm , làm chết nhiều ngƣời và tác động xấu đến sự phát

triển kinh tế xã hộ i.

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ ngƣời đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân

số thế giới ), tỷ lệ điều trị thành công trên 85% bằng hoá trị liệu , nhƣng tỷ lệ phát

hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ƣớc tính . Nhƣ vậy , còn rất nhiều bệnh nhân lao

không đƣợ c chƣ̃a trị đa ng tiếp tụ c lây lan cho cộ ng đồng và theo ƣớc tính củ a Tổ

chƣ́c Y tế Thế giới (TCYTTG), mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao

(65 triệu ngƣời) [3], [11].

Năm 1993, Tổ chƣ́c Y tế Thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạn g khẩn

cấp toàn cầu củ a bệnh lao và mối hiểm họa của nó trong tƣơng lai là bệnh lao kháng

thuốc [3], [11].

Năm 2005, TCYTTG ƣớc tính khu vƣ̣ c Đông Nam Á có 4,8 triệu bệnh nhân

lao. Trong đó số ca bệnh nhân lao mắc mới là gần 3 triệu, chiếm 34% toàn cầu. Số

ngƣời chết ở Đông Nam Á lá 512000 ngƣời, chiếm 1/3 toàn thế giới . Châu Phi có

số bệnh nhân lao là 3,8 triệu ngƣời ; số ca mới mắc là 2,5 triệu; số chết do bệnh lao

là 544000. Hai khu vƣ̣ c này có tình hình mắc lao nặng nề nhất thế giới [15].

WHO dƣ̣ báo chi phí điều trị cho bệnh nhân lao ở 27 nƣớc có số bệnh nhân

đông nhất sẽ lên đến 16 tỷ USD trong vòng 6 năm tới và coi bệnh lao là vấn đề y tế

cộ ng đồng, là một trong nhƣ̃ng nguyên nhân chính gây tƣ̉ vong trên thế giới. Không

nhƣ̃ng thế, nhiều vấn đề mới nảy sinh , thậm chí đƣợ c đánh giá là nghiêm trọ ng trên

Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

4

toàn cầu làm cho công tác phòng , chống lao gặp khó khăn , đe dọa phá vỡ nhƣ̃ng

thành quả đạt đƣợ c . Báo cáo của WHO đƣợc đƣa ra dựa trên thông tin thu thập

trong thời gian từ 2002-2006 ở 1/2 các nƣớc trên thế giới do các nƣớc còn lại không

hợp tác. Chẳng hạn tại Châu Phi chỉ có 6 nƣớc cung cấp thông tin về lao kháng

thuốc cho WHO. Trƣớc tình hình trên, WHO thúc giục các quốc gia và tổ chức từ

thiện trên thế giới tập trung đầu tƣ vào DOTS- một chiến dịch chuẩn hóa cách phát

hiện, điều trị đƣợc mở rộng. Đồng thời tổ chức y tế này cũng vừa đƣa ra chƣơng

trình DOTS- Plus (chƣơng trình DOTS mở rộng) liên quan đến việc sử dụng thuốc

đa dạng nhằm chống lại các dòng MDR. Việc kiểm soát dịch bệnh ở từng nƣớc sẽ

không thể ngăn chặn sức kháng thuốc của khuẩn lao, chỉ có sự đầu tƣ đồng bộ vào

các chiến dịch phòng chống bệnh trên toàn thế giới mới phát huy tác dụng [3], [13].

Tƣ̀ năm 2000 đến năm 2008, cơ quan phát triển quốc tế hoa kỳ (USAID) đã

cung cấp gần 900 triệu đô la cho chƣơng trình phòng , chống lao toàn thế giới .

Trong năm tài khoá 2009, USAID đã cung cấp 15 triệu đô l a cho cơ sở sản xuất

thuốc chống lao toàn cầu (DF). Bệnh lao là bệnh củ a ngƣời nghèo , lây lan nhanh

trong cộ ng đồng có điều kiện sống chật chộ i, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dƣỡng

kém. Mƣ́c độ nặng nề củ a bệnh lao đã ản h hƣở ng tới thu nhập quốc dân và chỉ số

phát triển con ngƣời của các quốc gia . Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy , mỗi

bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động , làm giảm 20-30% thu nhập

bình quân của gia đình và nó đã tác động tới 70% đối tƣợ ng lao độ ng chính củ a xã

hộ i [3], [6].

Đáng buồn là vào thời điểm hiện tại, đã 129 năm kể từ ngày nhà bác học

ngƣời Đức Robert Koch công bố tìm ra nguyên nhân gây ra bệnh lao thì căn bệnh

này vẫn chƣa đƣợc khống chế. Có nhiều cách lý giải thực trạng này song chúng ta

thấy đƣợc một số lý do chủ yếu nhƣ sau: Sự xuất hiện và mức độ hoành hành ngày

càng tràn lan của đại dịch HIV/AIDS; tình hình bệnh lao kháng thuốc; sự xuống cấp

của cơ sở y tế điều trị và chăm sóc bệnh nhân lao cũng nhƣ sự thiếu quan tâm đến

công tác phòng , chống lao tồn tại ở một số quốc gia, đặc biệt là những nƣớc kém

hoặc đang phát triển. Thêm vào đó là tình trạng di dân giữa các quốc gia, từ những

Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

5

nƣớc có số ngƣời mắc lao cao sang những nƣớc có số ngƣời mắc lao thấp; tình trạng

di dân, đô thị hóa trong mỗi quốc gia; tình trạng nghèo đói và đặc biệt là các

phƣơng tiện để chẩn đoán và điều trị lao trong nhiều năm qua vẫn chƣa có đổi mới

đáng kể [38].

1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam

Theo Ủy ban điều phối liên minh phòng , chống lao toàn cầu , Việt Nam xếp

thƣ́ 12 trong 22 nƣớc có gánh nặng bệnh lao trên toàn cầu, cao hơn nhiều bậ c so với

nhiều năm trƣớc đó. Hàng năm, Việt Nam có khoảng 150.000 bệnh nhân lao các thế

hệ xuất hiện và khoảng 12.000 ca đồng nhiễm lao/HIV. Việt Nam là nƣớc có nhiều

bệnh nhân lao đƣ́ng hàng thƣ́ ba ở khu vƣ̣ c Tây Thái Bình Dƣơng , sau Trung Quốc

và Philippin. Tỷ lệ dân số Việt Nam mắc lao là 44%. Tỷ lệ kháng th uốc là 32,5%

khá cao so với trong khu vực . Với nguy cơ mắc lao ƣớc tính hàng năm là 1,7%. Tỷ

lệ chết do lao khá cao : 26/100.000 dân tƣơng đƣơng với 20.000 ngƣời chết do lao

mỗi năm. Nhƣ vậy, ở Việt Nam cứ mỗi ngày có gần 400 ngƣời mắc bệnh lao và 55

ngƣời chết vì bệnh lao. Kết quả điều tra dịch tễ cho thấy nguyên nhân bệnh lao vẫn

tiếp tụ c tăng ở Việt Nam do tỷ lệ lao tăng ở nhóm tuổi trẻ và công tác giám sát lao

chƣa đƣợ c quan tâm đúng mƣ́c, nguồn nhân lƣ̣ c cho công tác phòng, chống lao ngày

càng mai một ; 50% số cán bộ y tế phòng, chống lao cấp huyện chƣa đƣợ c đào tạo...

đang là thƣ̉ thách lớn với công tác phòng, chống lao tại Việt Nam[11].

Một khảo sát vào năm 2004 của chƣơng trình chống lao quốc gia cho thấy

địa phƣơng nào có mật độ và lƣu chuyển dân số đông, y tế tƣ và hiệu thuốc phát

triển thì nơi đó có tỷ lệ điều trị thất bại, tái phát, mãn tính của bệnh lao cũng cao

nhất. Cụ thể số bệnh nhân tái phát và thất bại ở Đà Nẵng là 48, Cần Thơ 195 An

Giang 570 và TP.HCM là 1.664 [2].

Nƣớc ta thuộ c loại trung bình về dịch tễ trên thế giới. Đội ngũ cán bộ chống

lao các cấp hiện nay là 15772 (20/100.000 dân). Số cán bộ này tập trung chủ yếu ở

các tỉnh miền Bắc và Bắc Trung bộ . Trong khi đó , các tỉnh phía Nam , bao gồm