Luận văn thạc sĩ đánh giá tình trạng người mang ký sinh trùng sốt rét không biểu hiện triệu chứng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

ĐINH THỊ NGỌC DUYÊN

ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NGƢỜI MANG KÝ SINH TRÙNG

SỐT RÉT KHÔNG BIỂU HIỆN TRIỆU CHỨNG

BẰNG KỸ THUẬT RT-qPCR

TẠI HUYỆN TUY ĐỨC, TỈNH ĐĂK NÔNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8.42.01.14

Hƣớng dẫn khoa học: 1. TS.BS. Huỳnh Hồng Quang

2. TS. Trần Thanh Sơn

e

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi cùng với các

cán bộ y tế, nghiên cứu viên tại Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Quy Nhơn

và giảng viên của Đại học Quy Nhơn đồng thực hiện.

Các số liệu về kết quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa

từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Đinh Thị Ngọc Duyên

e

LỜI CẢM ƠN

Trƣớc hết ,tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn bộ Quý thầy cô

trƣờng Đại học Quy Nhơn, Quý thầy cô Khoa Khoa học Tự nhiên. Đồng thời, cho tôi

gửi lời cảm ơn sâu sắc, lòng kính trọng và biết ơn đến hai giáo viên trực tiếp hƣớng

dẫn : TS. BS. Huỳnh Hồng Quang và TS. Trần Thanh Sơn - là hai thầy giáo đã dành

nhiều thời gian, tâm huyết , tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và

chỉnh sửa toàn bộ đề cƣơng ,luận văn cũng nhƣ động viên tôi trong quá trình học tập

và làm luận văn.

Xin trân trọng cảm ơn đến Ban Lãnh đạo, Quý thầy cô, đồng nghiệp đang công

tác tại Khoa Nghiên cứu và Điều trị, Khoa Xét nghiệm - Sinh học phân tử thuộcViện

Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn đã tạo điều kiện cho tôi tham gia thực

hành tốt nhất tại thực địa cũng nhƣ la bô, đóng góp ý kiến sâu sắc trong bản thảo luận

văn hoàn chỉnh.

Xin trân trọng cảm ơn đến Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Phòng Đào tạo Sau đại

học Trƣờng Đại học Quy Nhơn, Khoa Khoa học Tự nhiên giúp cho tôi hoàn thiện hồ

sơ dự tuyển cao học, đồng thời đã tạo điều kiện thuận lợi để học tập và nghiên cứu.

Trân trọng cảm ơn BGH nhà trƣờng, Quý thầy cô đồng nghiệp Trƣờng THPT

số 3 Tuy Phƣớc, Tỉnh Bình Định – nơi tôi đang công tác đã cùng chia sẻ một phần

trách nhiệm, công việc và lịch giảng dạy linh hoạt nhất trong suốt thời gian theo học

lớp Đào tạo Thạc sĩ , Ngành Sinh học thực nghiệm, Trƣờng Đại học Quy Nhơn.

Kính gửi lời cảm ơn đến Cha mẹ - ngƣời luôn mong muốn con tiến bộ, thành

đạt. Cảm ơn ông xã và con trai là động lực mạnh mẽ, gánh vác việc gia đình cho tôi

yên tâm học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến tất cả ngƣời dân , trạm y tế thôn, buôn đã chia sẻ

thông tin và mẫu bệnh phẩm để số liệu xét nghiệm nghiên cứu một cách đầy đủ nhất.

Tác giả luận văn

Đinh Thị Ngọc Duyên

e

ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NGƢỜI MANG KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

KHÔNG BIỂU HIỆN TRIỆU CHỨNG BẰNG KỸ THUẬT RT-qPCR

TẠI HUYỆN TUY ĐỨC, TỈNH ĐĂK NÔNG

Học viên: Đinh Thị Ngọc Duyên | Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm.

Mã số: 8.42.01.14 | Khóa: 21, Trƣờng Đại học Quy Nhơn

Giới thiệu: Sốt rét là một trong những vấn đề y tế công cộng quan trọng và tỷ lệ mắc của chúng

đang có xu hƣớng giảm tại các vùng sốt rét lƣu hành tại Việt Nam, song ổ chứa tiềm ẩn là ngƣời

mang trùng không triệu chứng (NMTKTC) là một thách thức trong lộ trình loại trừ sốt rét. Nghiên

cứu này tiến hành nhằm xác định tỷ lệ NMTKTC bằng kỹ thuật RT-qPCR với đích mRNA tại tỉnh

Đăk Nông Phƣơng pháp nghiên cứu:. Nghiên cứu cắt ngang dựa vào cộng đồng giai đoạn (2019-

2020). Xét nghiệm lam máu nhuộm giêm sa, test nhanh và RT-qPCR để chẩn đoán sốt rét. Phân

tích dữ liệu trên Excel v.2010. Kết quả: Trong số 2809 ngƣời điều tra, tỷ lệ NMTKTC chung là

4,6% và theo vùng SRLH từ cao đến thấp ở xã Quảng Trực, Đăk Ngo và Đăk Buk So tại 2 thời

điểm giữa mùa mƣa và giữa mùa khô cho tỷ lệ lần lƣợt 12,8% so với 12,6%; 3,6% so với 3,6%,

1,5% so với 1,8%, sự thay đổi về tỷ lệ giữa hai mùa không có ý nghĩa, nhƣng khác biệt có ý nghĩa

giữa các vùng lƣu hành. Kết luận: Cùng sốt rét có triệu chứng, thì NMTKTC sẽ làm tăng thêm

gánh nặng bệnh tật tại vùng nghiên cứu. Do đó, trong lộ trình LTSR theo định hƣớng đến năm

2030, NMTKTC là một khía cạnh cần quan tâm.

Từ khóa: Ký sinh trùng sốt rét trong máu không triệu chứng, tỷ lệ mắc

EVALUATION OF ASYMPTOMATIC MALARIA PARASITEMIA BY RT-qPCR

TECHNIQUE IN DISTRICTS OF TUY DUC, DAK NONG PROVINCE

Backgrounds: Malaria is still an important public health and its prevalence has been declining in

malaria endemic zones in Vietnam, but hidden reservoir of asymptomatic parasitemia as challenge

in malaria elimination roadmap. This study aimed to determine the prevalence of asymptomatic

subjects by one-step reverse transcription-quantitative PCR take mRNA targets (RT-qPCR)

technique in Dak Nong province. Methods: A community based cross-sectional study was

conducted in 2019-2020. The multistage sampling technique was employed to select 2940

participants in total of three communes per district. A standard microscopy and rapid diagnostic

test were used to diagnosis, and RT-qPCR to diagnosis. Analyzed data using microsoft excel

version 2010. Results: Analyzed data from 2809 subjects, 4.6% were confirmed to be

asymptomatic malaria parasite carriers. According to high, moderate, and low endemic communes

of Quang Truc, Dak Ngo, and Dak Buk So in the mid-wet and mid-dry season surveyed point have

12.8% vs. 12.6%; 3.6% vs. 3.6%, and 1.5% vs.1.8%, respectively, non-significanntly changed in

two seasons, but significantly changed between different malaria endemic zone. Conclusions:

Along with symptomatic malaria, asymptomatic carriers will be plus more burden of disease in the

study sites. Therefore, on the way for malaria elimination back on the agenda by 2030,

asymptomatic malaria need to concern.

Key words: Asymptomatic malaria parasitemia, prevalence

e

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1

1. Lý do chọn đề tài luận văn ........................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 2

3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn..................................................... 2

4. Bố cục luận văn ......................................................................................... 3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4

1.1. Tình hình sốt rét thế giới và Việt Nam qua báo cáo năm 2017-2018 .... 4

1.1.1. Trên toàn cầu.................................................................................... 4

1.1.2. Tình hình sốt rét tại Việt Nam năm 2017-2018 ............................... 5

1.2. Một số phƣơng pháp phát hiện, chẩn đoán sốt rét hiện nay ................. 11

1.2.1. Xét nghiệm lam máu nhuộm giêm sa............................................. 12

1.2.3. Xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét ....... 15

1.3. Một số nghiên cứu đánh giá ngƣời mang KSTSR không triệu chứng . 16

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ HƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 38

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................... 38

2.1.1. Tiêu chuẩn tuyển chọn ................................................................... 38

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ......................................................................... 38

2.2. Địa điểm và thời gian ........................................................................... 38

2.3. Thiết kế nghiên cứu.............................................................................. 40

2.4. Cỡ mẫu ................................................................................................. 40

2.5. Thu thập mẫu nghiên cứu..................................................................... 42

e

2.6. Quy trình nghiên cứu ......................................................................... 42

2.7. Biến số và chỉ số đánh giá trong nghiên cứu........................................ 42

2.8. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 44

2.8.1. Xét nghiệm lam máu soi KHV....................................................... 44

2.8.2. Kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán nhanh SD-Bioline HRP2/pLDH

Pf/Pv......................................................................................................... 44

2.8.3. Kỹ thuật phân tử RT-qPCR phát hiện loài và thể Plasmodium

spp. ........................................................................................................... 45

2.9. Phân tích số liệu ................................................................................... 46

2.9.1. Phân tích dữ liệu............................................................................. 46

2.9.2. Dự kiến kết quả đầu ra ................................................................... 46

2.10. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu.................................................. 46

2.10.1. Sự chấp thuận của Hội đồng Đạo đức.......................................... 47

2.10.2. Cam kết tham gia nghiên cứu thông qua ..................................... 47

2.10.3. Quyền lợi của đối tƣợng tham gia................................................ 47

2.10.4. Bảo mật thông tin và số liệu......................................................... 47

2.10.5. Dịch vụ chăm sóc y tế .................................................................. 48

2.10.6. Sự khích lệ và động viên đối tƣợng tham gia hoàn tất................. 48

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................ 49

3.1. Đặc điểm chung của nhóm đối tƣợng tham gia nghiên cứu................. 49

3.2. Tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng ở ngƣời không triệu chứng bằng RT￾qPCR ........................................................................................................... 52

3.2.1. Tỷ lệ bệnh nhân có KST Plasmodium spp. dƣơng tính không

triệu chứng................................................................................................ 52

3.2.2. Kết quả định loài Plasmodium spp. ca dƣơng tính ở 3 xã.............. 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................ 81

1. KẾT LUẬN............................................................................................ 81

e

1.1. Tỷ lệ nhiễm KSTSR thể vô tính ở ngƣời không biểu hiện triệu

chứng........................................................................................................ 81

1.2. Xác định loài Plasmodium spp. và giao bào bằng phƣơng pháp

RT-qPCR.................................................................................................. 81

2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 82

3. TÍNH MỚI, TÍNH KHOA HỌC VÀ ĐIỂM HẠN CHẾ ĐỀ TÀI .......... 82

3.1. Tính mới............................................................................................ 82

3.2. Tính khoa học.................................................................................... 82

3.3. Điểm hạn chế..................................................................................... 83

CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ..................... 84

DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................. 85

QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (bản sao)

e

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ACTs

Artemisinin-based Combination

Therapies

Thuốc phối hợp có thành phần

artemisinins

BNSR Bệnh nhân sốt rét

CRFs Case Report Forms Mẫu Báo cáo ca bệnh

DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic

GCPs Good Clinical Practices Thực hành lâm sàng tốt

KHV Kính hiển vi

KST Ký sinh trùng

KSTSR Ký sinh trùng sốt rét

LHSR Lƣu hành sót rét

LTSR Loại trừ sốt rét

MDA Mass Drug Administration Điều trị thuốc hàng loạt

PCSR Phòng chống sốt rét

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

Nested PCR Nested Polymerase Chain Reaction PCR lồng

P. falciparum Plasmodium falciparum

P. vivax Plasmodium vivax

P. malariae Plasmodium malariae

P. ovale Plasmodium ovale

P. knowlesi Plasmodium knowlesi

qPCR Quantitative PCR Phản ứng chuỗi trùng định lƣợng

RDTs Rapid Diagnostic Tests Xét nghiệm chẩn đoán nhanh

RNA Ribonucleic acid

RT-qPCR Reverse Transcriptase qPCR PCR đ. lƣợng sao chép ngƣợc

us-qPCR Ultra-qPCR PCR định lƣợng siêu nhạy

SOPs Standard Operational Procedures Quy trình thực hành chuẩn

TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới

WHO World Health Organization

e

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các tỉnh/ thành có số KSTSR cao nhất năm 2018 vàso với 2017 ...........7

Bảng 2.1. Cỡ mẫu của những ngƣời không biểu hiện triệu chứng.........................41

Bảng 2.2. Các biến số và chỉ số thu thập trong nghiên cứu.....................................43

Bảng 3.1. Đặc điểm dân số trên nhóm nghiên cứu 3 xã thuộc huyện Tuy Đức.....49

Bảng 3.2. Đặc điểm lâm sàng trên nhóm nghiên cứu 3 xã thuộc huyện

Tuy Đức.................................................................................. 51

Bảng 3.3. Xét nghiệm lam máu và test chẩn đoán nhanh 3 xã, huyện Tuy Đức ...52

Bảng 3.4. Tỷ lệ KSTSR (+) bằng kỹ thuật RT-qPCR tại 3 xã có lƣu hành sốt

rét của huyện Tuy Đức tại thời điểm giữa mùa khô...............................53

Bảng 3.5. Tỷ lệ KSTSR (+) bằng kỹ thuật RT-qPCR tại 3 xã lƣu hành sốt rét

của huyện Tuy Đức tại thời điểm giữa mùa mƣa...................................54

Bảng 3.7. Định loài Plasmodium spp. tại 3 xã lƣu hành sốt rét huyện Tuy Đức...62

Bảng 3.6. So sánh tỷ lệ nhiễm KSTSR bằng kỹ thuật RT-qPCR tại 3

xã lƣu hành sốt rét huyện Tuy Đức tại hai thời điểm giữa

mùa mƣa và mùa khô .............................................................. 55

Bảng 3.8. Xác định giao bào Plasmodium spp. thời điểm giữa mùa mƣa tại 3

xã lƣu hành sốt rét huyện Tuy Đức.........................................................63

Bảng 3.9. Xác định giao bào Plasmodium spp. thời điểm giữa mùa khô tại 3

xã lƣu hành sốt rét huyện Tuy Đức.........................................................64

e

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Bản đồ phân bố ký sinh trùng sốt rét toàn quốc năm 2018 .............. 9

Hình 1.2. Cơ cấu ký sinh trùng sốt rét toàn quốc năm 2018 .......................... 10

Hình 1.3. Quy trình làm lam máu nhuộm giêm sa chẩn đoán sốt rét ............. 13

Hình 1.4. Phiên giải kết quả test nhanh sốt rét phát hiện P. faciparum/

P.vivax ............................................................................................ 14

Hình 1.5. Nguyên lý và phiên giải kết quả PCR trong chẩn đoán sốt rét....... 15

Hình 2.1. Bản đồ các xã nghiên cứu thuộc huyện Tuy Đức, tỉnh Đắk Nông . 39

Hình 3.1. Xác định giống Plasmodium spp. trên nhóm nghiên cứu bằng kỹ

thuật RT-qPCR trên hệ thống máy ABI 7500 fast. ........................ 53

Hình 3.2. Định loài Plasmodium spp. trên nhóm có kết quả KSTSR dƣơng

tính bằng kỹ thuật RT-qPCR trên hệ thống máy ABI 7500 fast .... 62

e

1

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài luận văn

Sốt rét hiện vẫn còn là vấn đề y tế công cộng và bệnh truyền nhiễm quan

trọng trên toàn cầu, đặc biệt tại các quốc gia và vùng lãnh thổ thuộc khu vực cận

sa mạc Sahara, châu Phi, Nam Mỹ và Tây Thái Bình Dƣơng. Theo Báo cáo sốt

rét thế giới năm 2017 (WHO, 2018) cho thấy trong năm 2017, ƣớc tính có

khoảng 219 triệu ca sốt rét xảy ra trên toàn thế giới, so với 239 triệu ca trong

năm 2010 và 217 triệu trƣờng hợp vào năm 2016. Mặc dù, so với năm 2010, năm

2017 có ít hơn khoảng 20 triệu trƣờng hợp nhƣng dữ liệu trong giai đoạn (2015-

2017) biểu hiện rằng không có sự tiến bộ đáng kể nào trong việc giảm số ca sốt

rét toàn cầu đƣợc thực hiện trong khoảng thời gian này. Điều này, một lần nữa,

các nƣớc trong khu vực Tiểu vùng sông Mê Kông, kể cả Việt Nam cho thấy dù

số mắc sốt rét giảm đáng kể trong những năm gần đây, song chúng ta lại đang

đối mặt với rất nhiều thách thức về mặt kỹ thuật nhƣ muỗi Anopheles spp. kháng

hóa chất diệt, ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp. kháng thuốc có hiệu lực

đang dùng, sốt rét trên nhóm dân đi rừng, ngủ rẫy và giao lƣu thƣờng xuyên qua

biên giới các quốc gia Việt Nam-Lào-Campuchia rất phức tạp.

Một khó khăn đang đối mặt đó là sốt rét vốn dĩ là bệnh truyền nhiễm có

miễn dịch không bền vững và tình trạng ngƣời mang ký sinh trùng không biểu

hiện triệu chứng phổ biến trong cộng đồng đang sống và làm việc tại vùng sốt rét

lƣu hành, loại nhiễm trùng này không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp xét

nghiệm thƣờng quy giêm sa hay test chẩn đoán nhanh mà chỉ có phƣơng pháp

phân tử siêu nhạy mới có thể phát hiện đƣợc. Nếu không đánh giá đúng mức

cũng nhƣ không điều trị tiệt căn nhóm bệnh nhân này, thì khâu lan truyền bệnh

vẫn tiếp diễn, dai dẳng và không thể đạt đƣợc mục tiêu loại trừ bệnh sốt rét.

Miền Trung-Tây Nguyên là khu vực có số ca mắc chiếm gần 70% so với

cả nƣớc, nhất là các tỉnh Tây Nguyên nhƣ Gia Lai, Đăk Nông, Đăk Lăk, Kon

e

2

Tum, tình trạng nhiễm trùng dai dẳng khó loại trừ do nhiều nguyên nhân, kể cả

ngƣời lành mang ký sinh trùng trong cộng đồng - Vậy làm thế nào để đánh giá

chính xác hiện tƣợng trên và đề xuất biện pháp can thiệp trong tƣơng lai?.

Với ý nghĩa xác định tỷ lệ ngƣời nhiễm ký sinh trùng không triệu chứng

bằng các kỹ thuật hiện đại để từ đó đề xuất biện pháp can thiệp phù hợp, đề tài

“Đánh giá tình trạng ngƣời mang ký sinh trùng sốt rét không biểu hiện triệu chứng

bằng kỹ thuật RT-qPCR tại huyện Tuy Đức, tỉnh Đăk Nông” đƣợc tiến hành.

2. Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Xác định tỷ lệ nhiễm KSTSR thể vô tính ở ngƣời không biểu hiện triệu

chứng trên nhóm ngƣời tham gia nghiên cứu tại ba xã Quảng Trực, Đăk Ngo và

Đăk Buk So, huyện Tuy Đức, tỉnh Đăk Nông;

2.1. Xác định tỷ lệ ngƣời mang thể vô tính và giao bào Plasmodium

falciparum và P. vivax không triệu chứng bằng kỹ thuật RT-qPCR tại điểm

nghiên cứu.

3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

3.1. Ý nghĩa khoa học

Ngƣời mang ký sinh trùng sốt rét không triệu chứng (NMTKTC) là một

trong những thách thức để phát hiện và điều trị tiệt căn ca bệnh vì hai công cụ kính

hiển vi và test nhanh đƣợc Tổ chức Y tế thế giới và Bộ Y tế khuyến cáo xét nghiệm

thƣờng quy lại không thể phát hiện đƣợc bởi mật độ KSTSR rất thấp. Nghiên cứu

này áp dụng kỹ thuật phân tử siêu nhạy RT-qPCR định lƣợng phát hiện RNA của

Plasmodium spp. nên khả thi phát hiện nhiều ca bệnh cao hơn, giúp điều trị và quản

lý ca bệnh toàn diện. Số liệu từ nghiên cứu sẽ cho thấy một gánh nặng bệnh tật từ

sốt rét không những ca bệnh có triệu chứng mà còn một tỷ lệ nhỏ không biểu hiện

triệu chứng trong cộng đồng. Nếu không điều trị nhóm này, chúng có cơ hội lan

rộng một khi có muỗi truyền bệnh sốt rét trong vùng đó.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Hiện chỉ có những ca bệnh bệnh đƣợc chẩn đoán xác định thông qua

e