Một số phản ứng sinh hóa định danh vi sinh vật

Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4

MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT

1. Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrate

Nguyên tắc: Xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat là nguồn

hydratcarbon duy nhất. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và

thay đổi màu của chỉ thị màu

– Cấy vi khuẩn vào môi trường Citrat Simmons, ủ 35 – 37oC/24 h

– Phản ứng dương tính: màu xanh nước biển

– Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu

• E. coli

• Enterobacter aerogenes

• Dương tính: môi trường đổi màu xanh lá cây sang xanh nước biển

• Âm tính: không đổi màu

2. Thử nghiệm Catalase

Nguyên tắc: Phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo

phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn

hiếu khí và kỵ khí tùy ý

- Lấy một ít vi khuẩn vào que cấy và nhúng vào giọt H2O2 .

Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện

Phản ứng âm tính (-): không có bọt khí xuất hiện

- Không nên sử dụng vi khuẩn cấy trên thạch máu vì dễ dương tính giả

3. Thử nghiệm Oxydase

Nguyên tắc: Phát hiện khả năng sinh enzym cytochrome c oxidase của

vi khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa , Neisseria gonorrhoeae và Campylobacter

jejuni là những vi khuẩn gây bệnh có Oxydase (+)

- Lấy một ít chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần bôi lên một tờ giấy lọc. Nhỏ

thuốc thử(N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride)

- Phản ứng dương tính: có màu tím. Đọc kết quả trong vòng 10 giây đầu

• Phản ứng Oxydase sử dụng thuốc thử (N,N,N',N'-tetramethyl-p￾phenylenediamine dihydrochloride)

• Phản ứng dương tính: có màu tím.

• Phản ứng xuất hiện trong vòng 10 giây đầu.

1

Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4

4. Thử nghiệm phân giải Ure

Nguyên tắc: phát hiện enzym urease phân giải urea thành ammonia và

carbondioxide. Ammonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường.

– Là phản ứng đặc trưng cho các loài Proteus.

– Cấy vi khuẩn vào canh thang Ure. Ủ 37oC/24 – 48 h

– Phản ứng dương tính: môi trường có màu tím đỏ. Phản ứng âm

tính: không chuyển màu

• Dương tính: môi trường chuyển thành màu tím

• Âm tính: không màu

5. Thử nghiệm Coagulase (đông huyết tương)

Nguyên tắc: Phát hiện sự có mặt của men Coagulase bằng phản ứng

đông huyết tương thỏ

–Là phản ứng phân biệt tụ cầu gây bệnh và không gây bệnh

– Cho vào ống nghiệm 0,5 ml huyết tương thỏ và 0,5 ml dịch cấy vi

khuẩn. Ủ ấm 37oC/4-24h

–Phản ứng dương tính: xuất hiện khối đông tụ. Nếu sau 24h không

thấy xuất hiện khối đông tụ: phản ứng âm tính.

Dương tính: hình thành khối đông huyết tương

6. Thử nghiệm sinh Idol

Nguyên tắc: phát hiện các vi sinh vật có enzym tryptophanase chuyển

hóa trypton tạo thành indol

- Cấy vi khuẩn vào nước trypton, ủ 37oC/24 h

- Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs, phản ứng dương tính: có vòng màu đỏ

cánh sen nổi lên trên (do Indol kết hợp với p-dimethylaminobenzal dehyde

trong thuốc thử Kovacs), nếu không có màu hoặc màu vàng: phản ứng âm

tính

- Với các chủng sinh Indol chậm: thử sau 48 h

– Dương tính: màu đỏ cánh sen

– Âm tính: màu vàng

7. Thử nghiệm MR

Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid

bền.

- VK có phản ứng MR dương tính: pH môi trường ngày càng giảm

2

Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4

- VK có phản ứng MR âm tính: pH môi trường tăng dần (các sản phẩm

có tính acid tạo thành lại chuyển hóa tạo thành các sản phẩm trung tính)

- Cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP. Ủ 37oC từ 2-5 ngày

- Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay. Phản ứng (+) có

màu đỏ, âm tính màu vàng

8. Thử nghiệm VP

Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzym chuyển hóa 2,3

butanediol thành acetoin khi có ô xy và chuyển hóa tiếp acetoin thành

diacetyl

– Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo phức diacetyl –

guanidin có màu đỏ

– Cấy vi khuẩn vào môi trường MR – VP. Ủ 37oC/24 – 48 h

– Nhỏ 6 giọt thuốc thử A (5% α naphtol) và 2 giọt thuốc thử

B( KOH 40%). Lắc nhẹ

– Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 h

– Phản ứng (+): có màu đỏ trên mặt môi trường

9. Thử nghiệm lên men đường

Nguyên tắc:Vi khuẩn có khả năng lên men đường sẽ làm giảm pH dẫn

đến thay đổi màu của môi trường

* PHƯƠNG PHÁP MPN:

- Định lượng các vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose sinh hơi

- Cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng chọn lọc có ống Durham. Ủ

37oC/24 – 48 h

- Vi khuẩn lên men đường lactose sinh hơi sẽ làm thay đổi màu môi

trường và có bóng hơi trong ống Durham

* Thử khả năng lên men đường

A. Lactose broth

• Escherichia coli

• Proteus vulgaris

• Phản ứng dương tính: màu vàng, sinh hoặc không sinh hơi

• Phản ứng âm tính: không đổi màu

• Sinh hơi ◊ hình thành bóng hơi trong ống durham

* LÊN MEN ĐƯỜNG, SINH H2S (TSI)

3

Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4

• Gồm ba đường: Lactose, succrose, glucose

• Cấy hai bước

- Đầu tiên cấy trên mặt nghiêng

- Thứ hai: cấy đâm sâu vào chân thạch. Ủ 37oC/24h

• Nếu chỉ lên men Glucose.

- Một lượng nhỏ glucose trong môi trường lên men trong giờ đầu

nuôi cấy.

- Sau đó, vi khuẩn lấy năng lượng trong quá trình oxy hóa peptone ◊

phần thạch nghiêng có màu đỏ (hiện tượng kiềm hóa môi trường)

- Peptone ở phần chân thạch không được sử dụng vì không có O2 ◊

phần chân vẫn giữ nguyên màu vàng

* LÊN MEN ĐƯỜNG TRÊN TSI

• Nếu lên men cả glucose, sucrose và/hoặc lactose

- Từ 18 – 24h, toàn bộ phần chân và mặt nghiêng thạch có màu vàng

- Sau 24 h: kiềm hóa môi trường do vi khuẩn sử dụng pepton, môi

trường chuyển màu đỏ (chỉ ở phần mặt nghiêng vì pepton chuyển hóa trong

điều kiện hiếu khí.

- Nếu lên men sinh hơi sẽ thấy các bọt khí hoặc nứt thạch

- Phân giải sodium thiosulfate thành hydrogen sulfide: phần chân thạch

có màu đen (H2S +)

10. Thử nghiệm khử nitrat

Nguyên tắc: Phát hiện enzym nitratase xúc tác khử nitrat thành nitrit và

ni tơ phân tử

- Một số vi khuẩn có khả năng khử NO3 thành NO2 và các hợp chất

chứa Nitơ khác như amonia (NH3) và khí Nitơ (N2)

NO3 ----> NO2 ----> NH3 or N2

- Nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang nitrat,ủ ở 370 C/24h. Sau đó nhỏ

thuốc thử có chứa alpha-napthylamine và sulfanilic acid . Hai hợp chất này

kết hợp với nitrit để tạo thành HC có màu đỏ (phản ứng dương tính).

* Tuy nhiên, nếu sản phẩm phân giải là amoniac và khí nitơ, ống thử

nghiệm sẽ không chuyển màu nhưng vẫn được báo cáo là phản ứng nitrat

dương tính. Trường hợp này cần tiến hành tiếp bước sau:

4

Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4

- Cho thêm một ít bột kẽm vào ống thử, kẽm sẽ chuyển hóa nitrat thành

nitrit và ống thử sẽ có màu đỏ. Như vậy, kết luận phản ứng âm tính

- Nếu ống thử không chuyển màu, phản ứng dương tính (vi khuẩn đã

chuyển hóa hết nitrat có trong môi trường)

11. Thử nghiệm phân giải hồng cầu (tan máu)

- Một số vi khuẩn có khả năng phân giải hồng cầu có thể quan sát thấy

trên thạch máu.Vùng tan máu được hình thành xung quanh khuẩn lạc. Có ba

dạng tan máu:

Tan máu (ß): vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc

Tan máu (α): vùng xám xanh xung quanh khuẩn lạc

Tan máu (γ): không có vùng tan máu

12. Thử nghiệm khả năng di động

Nguyên tắc: phát hiện khả năng di của vi khuẩn nhờ có roi ở đầu tế

bào.

– Có thể thử khả năng di động bằng cách cấy đâm sâu trong thạch

mềm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ 37oC từ 18-24h

– Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có thể di động xung quanh đường

cấy, xoắn ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch

13. Thử nghiệm hóa lỏng gelatin

Nguyên tắc: phát hiện vi khuẩn có men gelatinase phân giải và hóa lỏng

gelatin, quan sát thấy ngay cả khi nhiệt độ thấp hơn 28oC

• Có hai phương pháp xác định sự có mặt của men gelatinase

- Cấy vi khuẩn vào thạch dinh dưỡng gelatin, ủ nhiệt độ phòng trong 14

ngày

• Phương pháp gelatin Strip

- Sử dụng dải màu có phủ gelatin. Nếu phản ứng dương tính, có sự thay

đổi màu.

Một số chủng có khả năng hóa lỏng gelatin chậm nên giữ lại thử nghiệm

trong hai tuần.

5

Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4

TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN - NẤM MỐC

NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP

Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm khóm nấm trên môi trường thạch, sau khi

ủ hiếu khí ở nhiệt độ 28 ±1oC trong thời gian từ 5 - 7 ngày. Số lượng bào tử

nấm men, nấm mốc trong 1g(ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm

được tính theo số khóm nấm đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ

pha loãng

PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

THIẾT BỊ - DỤNG CỤ

• Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm

• Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn.

• Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1oC.

• Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 30 ±1oC.

• Tủ sấy khô.

• Nồi hấp áp lực .

• Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml.

• Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn .

• pH met hoặc giấy đo pH.

HÓA CHẤT – MÔI TRƯỜNG

• Thạch dùng cho Vi sinh vật

• Pepton dùng cho Vi sinh vật

• Muối tinh khiết (NaCl)

• Glucoza tinh khiết

• Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4)

• Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4)

• Axit lactic dung dịch 20% hoặc 40%

• Axit xitric dung dịch 20%

• Dung dịch NaOH 0,1N

CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ

• Chuẩn bị môi trường

6