KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 8 pptx

ứng là 15mM và 1%). Để cho phản ứng ở 60 ºC trong 10 phút.

9) Sau phản ứng,chuyển dịch phản ứng (khoảng 1 ml) sang ống loại 10 ml.

Thêm vào chai scintilation 0,5 ml dung dịch rửa, xử lý 10 phút ở 65 ºC.

Sau đó hút dung dịch rửa trộn với dịch phản ứng đã hút ra trước khi xử lý

dung dịch rửa. Dịch hỗn hợp thu được khoảng 1,5 ml.

Dung dịch rửa chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, SDS 1% và

EDTA 5mM.

10) Thêm 40 µg proteinase K (nồng độ cuối cùng 25 µg/ml), cho phản ứng

xảy ra ở 37 ºC trong 30 phút.

11) Thêm dung dịch NaCl vào dịch phản ứng cho đạt nồng độ 0,1M và 2,5

lần thể tích ethanol, để 10 phút ở −80 ºC cho kết tủa. Quay li tâm 10.000

v/ph trong 10 phút thu tủa sản phẩm. Hòa tủa này trong 50 µl TE.

TE chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM và EDTA 2mM.

4. Hybridization

1) Ngâm màng đã thẩm đốm DNA plasmid (bước 2.) vào dung dịch run￾on assay prehybridization (1 ml cho một màng có diện tích khoảng 20

cm2

) trong 4 - 16 giờ ở 42 ºC.

Dung dịch run-on assay prehybridization (dịch lai tiền

khởi cho run-on assay) chứa formamide ở nồng độ 50%, sodium

phosphate (pH 6,5) 50mM, SSC 5× (25 ml SSC 20× trong 100 ml),

DNA tinh dịch cá hồi biến tính 250 µg/ml và Denhardt 1× (10 ml

dung dịch Denhardt 10× trong 100 ml).

2) Thay bằng dung dịch run-on assay hybridization (dịch lai). Tiến hành

lai trong 48 giờ ở 42 ºC.

Dung dịch run-on assay hybridization (dịch lai cho run￾on assay) chứa 4 phần dịch run-on assay prehybridization và 1

phần dung dịch dextran sulfate 50%.

3) Rửa màng bằng 100 ml dung dịch chứa SSC 2× và SDS 0,1% ba lần ở

nhiệt độ phòng mỗi lần 5 phút.

4) Rửa màng bằng 100 ml dung dịch chứa SSC 2× và SDS 0,1% hai lần ở

nhiệt độ 65 ºC mỗi lần 15 phút.

5) Hong khô, gói trong giấy nhựa mỏng (Saran wrap), thực hiện tự ký

phóng xạ.

6) Đọc kết quả dựa vào độ đậm nhạt trên film X-quang. Quá trình phiên

1 2 5