KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 6 pdf

Dung dịch hybridization chứa 1,5 ml NaCl 5M, 0,1 ml

Tris-HCl 2M (pH 8,0), 0,05 ml EDTA 0,5M, 1 ml dung dịch

Denhardt 10×, 1ml SDS 10%, 0,5 ml DNA cá hồi đã biến tính 1

mg/ml và mẫu dò đánh dấu bằng 32P đã biến tính 1 - 3×107

cpm,

tổng 10 ml.

Dung dịch Denhardt 10× chứa 2% BSA fraction V, 2%

polyvinyl pyrrolidone và 2% ficoll 400 (Pharmacia); sử dụng BSA

thường gặp nấm mốc nên khi dùng mới pha, bảo quản ở tủ lạnh chỉ

được 1 tháng.

Chú ý: Một số màng lọc như Gene Screen Plus... cần phải lai tiền

khởi (prehybridization) 8 giờ.

Có thể tái sử dụng màng lọc nylon (như Nitran của S&S...), khi đó

ngâm màng trong NaOH 0,2N ở nhiệt phòng trong 2 giờ loại bỏ mẫu dò

không có tương tác bổ sung, rửa nước cho sạch rồi trung hòa bằng dung

dịch chứa 0,2 M Tris-HCl (pH 7,2) và 0,1% SDS. Ngâm trong túi

polyethylene chứa dung dịch prehybridization trong 2 giờ ở 65 phút rồi

bảo quản ở tủ lạnh, bảo quản được lâu trong buồng lạnh sâu. Khi dùng lấy

ra cho ấm ở 65 ºC rồi thực hiện từ bước lai (hybridization).

3. Lai gel khô

Do thiết bị tổng hợp DNA ngày càng phổ biến, việc sử dụng DNA

tổng hợp làm mẫu dò cho lai Southern ngày càng trở nên có thể. Trong

những trường hợp đó, không cần sử dụng màng mà có thể sử dụng gel trực

tiếp để lai với cảm độ cao và ngày càng trở nên phổ biến. Các bước có thể

tiến hành như sau:

1) Chế gel agarose 1% (thông thường 0,6 - 8%). Khi đó đổ lớp gel hơi

mỏng hơn thông thường ít nhiều (chỉ khoảng 3 - 5 mm). Điện di (với điện

áp cao hơn hay thời gian kéo dài hơn so với gel có nồng độ agarose thấp

hơn), xử lý kiềm và trung hòa gần giống như đối với màng nitrocellulose

hay màng nylon.

-Xử lý kiềm: NaOH 0,5N - NaCl 0,15M, nhiệt độ phòng 30 phút;

-Trung hòa: Tris (pH 7,0) 0,5M - NaCl 0,15M, nhiệt độ phòng, 30

phút.

2) Sau khi điện di, nhuộm ethidium bromide, chụp ảnh lưu tư liệu, nếu

cần.

Tuy nhiên, nếu khi điện di đã cho DNA MW marker phóng xạ (như

[

32P]-DNA đã tiêu hóa bằng Hind III) rồi thì bỏ qua bước chụp ảnh.

89