KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 3 ppsx

ống nuôi cấy.

2.1. Phương pháp điều chế dịch phage dung khuẩn

1) Dùng tăm (hoặc đầu pipet) vô trùng lấy một plaque duy nhất đã sàng lọc

được genomic liabrary hoặc cDNA liabrary khuấy vào 100 µl môi trường

SM.

Môi trường SM chứa 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 25

ml Tris-HCl 2M (pH 7,5), 5 ml gelatin 2%, thêm nước cho đủ 1 lít,

hấp cao áp tiệt trùng.

2) Để một giờ ở nhiệt độ phòng.

3) Cho vào 20 µl vi khuẩn đã bồi dưỡng qua đêm, để 15 phút ở 37 ºC.

4) Thêm 5 ml môi trường NZYM, bồi dưỡng qua đêm ở 37 ºC. Cuối cùng

môi trường trở nên trong mặc dù không hoàn toàn và quan sát thấy các

mẫu cặn phân giải của vi khuẩn.

Môi trường NZYM chứa 10,0 g NZ amine, 5,0 g NaCl, 5,0

g cao nấm men (yeast extract), 2,0 g MgSO4.7H2O, chế thêm nước

cất cho đủ 1 lít, hấp cao áp tiệt trùng.

5) Thêm 100 µl chloroform, trộn đảo 15 phút.

6) Quay li tâm 3.000 v/ph trong vòng 10 phút, hút lấy nước mặt (dịch

phage dung khuẩn) chuyển qua ống khác.

7) Với phương pháp này có thể thu được phage với hiệu giá cao đến 1010

pfu/ml.

2.2. Điều chế lượng nhỏ DNA phage

1) Thêm vào dịch phage dung khuẩn (thu được ở 7) mục trên) 5 µg/ml

DNase I và 5 µg/ml RNase A, ủ 30 phút ở 37 ºC.

2) Thêm dung dịch PEG 6000 20% - NaCl 2M đến mức 10% so với tổng

thể tích, trộn rồi để trên nước đá 1 giờ. Polyethylene glycol 6000 gây kết

tủa DNA.

Dung dịch PEG 6000 20% - NaCl 2M chứa 20%

polyethylene glycol 6000 và 2 mol/lít NaCl so với thể tích toàn bộ.

3) Quay li tâm 3.000 v/ph 20 phút ở 4 ºC, loại bỏ hoàn toàn nước mặt.

4) Thêm 0,5 ml SM vào cặn, tạo huyền phù rồi chuyển sang ống

Eppendorf.

35