KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 5 potx

thêm vào đó 0,1, 0,3, 1,0 3,0 và 10 đơn vị Sau 3A, ủ một giờ.

2) Làm lạnh ở trong nước đá, thêm EDTA cho đến 20 mM để dừng phản

ứng. Điện di 3 µg DNA trong gel agarose 0,4%.

3) Chọn chế độ xử lý với lượng Sau 3A cho nhiều đoạn DNA có phân tử

lượng 15 - 20 kb nhất.

1.3. Điều chế đoạn DNA để đưa vào tổ hợp

1) Cắt lượng 200 µg DNA có phân tử lượng lớn với nồng độ Sau 3A đã

chọn, bên cạnh hai nồng độ Sau 3A lượng lớn hơn (1,5 lần) và nhỏ hơn

(0,7 lần).

2) Làm lạnh ở 0 ºC, thêm cho đạt 20 mM EDTA để dừng phản ứng.

3) Lấy 3 µg để điện di trong gel agarose 4%.

4) Chọn sản phẩm chứa nhiều đoạn DNA có độ dài thích hợp, thực hiện li

tâm phân đoạn trong các ống chênh lệch mật độ đường.

5) Chọn các phân đoạn có độ dài 15 - 20 kb (di động chậm hơn MW

marker chút ít do nồng độ muối cao), thêm vào đó 2 lần TE (và carrier

RNA, cho dễ kết tủa), kết tủa bằng ethanol.

6) Kiểm tra lại phân tử lượng của các đoạn DNA bằng cách điện di trong

gel agarose bên cạnh DNA MW marker.

1.4. Ligation (kết nối)

1) Thông thường thiết lập phản ứng với các trường hợp kết nối DNA

vector và DNA mẫu với một số tỷ lệ nồng độ khác nhau để tăng khả năng

hình thành những tổ hợp kết nối thích hợp. Đồng thời, cũng nên thiết lập

phản ứng kết nối khống với chỉ DNA mẫu (không có DNA vector).

Phản ứng chính có thể thực hiện trong ống Eppendorf với tổng

lượng 10 µl chứa những thành phần sau: 2 µg DNA vector, 1 µg DNA

mẫu, 1 µl dung dịch đệm kết nối (ligation buffer) 10×, 100 đơn vị T4

ligase, thêm nước cho đủ 10 µl. Các thí nghiệm kết nối "khống" có lượng

bằng 1/2 thí nghiệm chính. (Dung dịch đệm kết nối 10× được bán kèm với

enzyme T4 ligase).

2) Ủ 14 °C trong 1 đêm.

3) Lấy 2 µl dịch từ mỗi ống pha với 5 µl nước và 2 µl dung dịch màu tải

mẫu 6× và điện di trong agarose, xác nhận sự kết nối (độ dài DNA vượt

quá 50 kb).

71