KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 4 doc

mỏng Saran wrap, chiếu tử ngoại từ phía dưới để kiểm tra RNA (nếu có,

RNA sẽ phát huỳnh quang da cam).

8) Thêm 1/10 thể tích sodium acetate (pH 5,1) và hai lần lượng ethanol

cho kết tủa ở −20 ºC.

9) Nếu cần tinh chế poly(A)+RNA thì lặp lại các bước từ bước tải

Oligo(dT) cellulose.

1.3. Phục hồi cột

1) Rửa cột bằng mấy ml NaOH 0,1N.

2) Rửa bằng mấy ml dung dịch dung xuất cho đến khi dịch thoát ra có

phản ứng trung tính.

3) Cân bằng cột bằng dung dịch đệm NaCl 0,5M.

4) Nếu cần bảo quản lâu thì sau khi tải cột, cho cột đầy nước cất pha

sodium azide 0,02% hoặc dung dịch đệm dung xuất chứa sodium azide

(NaN3), nút kín hai đầu bằng parafilm, cất ở 4 ºC.

2. Phân đoạn nhờ li tâm chênh lệch nồng độ saccharose

1) Lấy ống li tâm siêu tốc, Hitachi 13 PA chẳng hạn, ngâm trong dung

dịch diethyl pyrocarbonate 1% ở 37 °C qua đêm, hấp cao áp tiệt trùng, để

khô. Cho vào đó dung dịch đường chênh lệch mật độ từ 5, 10, 15 và 20%

(hoặc 5 ~ 30%).

Dung dịch đường chênh lệch mật độ chứa saccharose 5%

(và 10, 15, 20 và 30%, theo khối lượng/thể tích), Tris-HCl (pH 7,5)

10mM, EDTA 1mM và SDS 0,1%, hấp cao áp tiệt trùng.

2) Lắp ống chứa dịch đường chênh lệch mật độ vào rotor rồi lắp vào máy

hạ nhiệt độ xuống mức nhiệt làm việc của máy là 15 °C trong 2 giờ cho

cân bằng nhiệt độ toàn hệ thống li tâm.

3) Hòa tan kết tủa do ethanol của khoảng 100 µg poly(A)+RNA trong 100 -

200 µl nước cất đã tiệt trùng, thêm vào 1/20 lượng SDS 20%.

4) Đun nóng 70 °C trong 15 phút sau đó hạ nhanh nhiệt độ.

5) Tải mẫu lên đường chênh lệch mật độ. Để có dấu độ lớn phân tử lượng

(size marker) đồng thời thực hiện với các RNA có độ lớn đã biết trước

(ribosome 28S, 18S) trong ống khác cũng chứa dung dịch đường chênh

lệch mật độ cùng loại và cũng được li tâm đồng thời.

6) Li tâm siêu tốc (với RPS 40 T Hitachi chẳng hạn). Li tâm trong 5 - 20%

53