Kết hợp phương pháp PCR và Reverse Dot Blot phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho con người / Nguyễn Trọng Nghĩa

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

----------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG

Tên đề tài:

KẾT HỢP PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ REVERSE DOT

BLOT PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI CÁC TÁC NHÂN VI

KHUẨN TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM GÂY BỆNH CHO

CON NGƢỜI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4/2014

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG

Tên đề tài:

KẾT HỢP PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ REVERSE DOT

BLOT PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI CÁC TÁC NHÂN VI

KHUẨN TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM GÂY BỆNH CHO

CON NGƢỜI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN TRỌNG NGHĨA Nam, Nữ:

Dân tộc: KINH

Lớp, khoa: SH10A3 – Khoa công nghệ sinh học

Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

Ngành học: Công nghệ sinh học vi sinh – sinh học phân tử

Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4/2014

Trang i

MỤC LỤC

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ..........................................................v

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ........ix

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ...........................................................x

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ...............................................................................................xi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................................xiv

ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................................1

PHẦN I. TỔNG QUAN .....................................................................................................3

I.1. SƠ LƢỢC VỀ CÁC NHÓM VI KHẨN GÂY BỆNH THƢỜNG GẶP ...................3

I.1.1. Bacillus cereus ........................................................................................................3

I.1.1.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................3

I.1.1.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................3

I.1.1.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................3

I.1.2. Brucella spp. ...........................................................................................................3

I.1.2.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................3

I.1.2.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................4

I.1.2.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................4

I.1.3. Clostridium botulinum............................................................................................4

I.1.3.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................4

I.1.3.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................4

I.1.3.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................5

I.1.4. Clostridium perfringens..........................................................................................5

I.1.4.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................5

I.1.4.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................5

I.1.4.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................6

I.1.5. Escherichia coli.......................................................................................................6

I.1.5.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................6

I.1.5.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................6

I.1.5.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................7

I.1.5.4. Phân loại ...........................................................................................................7

I.1.6. Listeria monocytogenes...........................................................................................8

I.1.6.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................8

Trang ii

I.1.6.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................8

I.1.6.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................8

I.1.7. Staphylococcus aureus............................................................................................9

I.1.7.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................9

I.1.7.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................9

I.1.7.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................10

I.1.8. Salmonella spp......................................................................................................10

I.1.8.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................................10

I.1.8.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ......................................................................10

I.1.8.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................11

I.1.9. Shigella spp. ..........................................................................................................11

I.1.9.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................................11

I.1.9.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ......................................................................11

I.1.9.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................12

I.1.10. Vibrio cholerae ......................................................................................................12

I.1.10.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................................12

I.1.10.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ......................................................................12

I.1.10.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................13

I.1.11. Vibrio parahaemolyticus.......................................................................................13

I.1.11.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................................13

I.1.11.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ......................................................................13

I.1.11.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................14

I.1.12. Yersinia enterocolitica ..........................................................................................14

I.1.12.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................................14

I.1.12.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ......................................................................14

I.1.12.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................15

I.2. THÔNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA.........................................................15

I.2.1. Gen 16S rDNA......................................................................................................15

I.2.2. Gen 23S rDNA......................................................................................................16

I.3. CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH CHO CON NGƢỜI..

.......................................................................................................................................17

I.3.1. Kỹ thuật định danh truyền thống [27] ...............................................................17

I.3.2. Kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại ....................................................................19

I.3.2.1. Kỹ thuật PCR[2][14].......................................................................................19

Trang iii

I.3.2.2. Multiplex PCR[14] .........................................................................................24

I.3.2.3. Phƣơng pháp microarray [66][61] [14] ..........................................................24

I.3.2.4. Phƣơng pháp Reverse dot blot [14].............................................................25

I.4. CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NHANH CHÓNG VÀ ĐỒNG

THỜI TÁC NHÂN VI SINH VẬT GÂY BỆNH .................................................................26

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................29

II.1. VẬT LIỆU....................................................................................................................29

II.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................................................................29

II.2.1. Thu thập dữ liệu và khảo sát in silico.................................................................29

II.2.2. Thu thập dữ liệu...................................................................................................29

II.2.3. Khảo sát in silico ..................................................................................................29

II.2.3.1. Thu thập tr nh tự gen mục tiêu 16S – 23S rRNA ...........................................29

II.2.3.2. Thu thập các cặp mồi......................................................................................29

II.2.3.3. Phƣơng pháp khảo sát các cặp mồi, thiết kế mồi............................................30

II.2.4. Khảo sát thực nghiệm..........................................................................................30

II.2.4.1. Tách chiết DNA..............................................................................................30

II.2.4.2. Kiểm tra chất lƣợng DNA thu nhận bằng phƣơng pháp đo quang phổ..........31

II.2.4.3. Phản ứng PCR: ...............................................................................................32

II.2.4.4. Phƣơng pháp điện di:......................................................................................33

II.2.4.5. Phƣơng pháp lai RDB.....................................................................................34

II.2.4.6. Khảo sát độ nhạy của phƣơng pháp PCR-RDB..............................................34

II.2.4.7. Khảo sát khả năng phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh

cùng lúc ........................................................................................................................35

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................................36

III.1. Kết quả thu thập dữ liệu và khảo sát in silico.......................................................36

III.1.1. Thu thập dữ liệu ...............................................................................................36

III.1.2. Kết quả khảo sát in silico.................................................................................37

III.1.2.1. Thu thập và đánh giá hệ cặp mồi, mẫu dò ..................................................37

III.1.2.2. Khảo sát hệ cặp mồi....................................................................................39

III.1.2.3. Khảo sát bộ mẫu dò.....................................................................................47

III.2. Kết quả thực nghiệm ...............................................................................................69

III.2.1. Tách chiết DNA ................................................................................................69

III.2.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi 16S rDNA..........................................71

Trang iv

III.2.3. Kết quả khuếch đại của cặp mồi 16S_F – 16S_R trên các chủng vi khuẩn

đối chứng ............................................................................................................................72

III.2.4. Kết quả lai RDB trên các chủng vi khuẩn đối chứng....................................73

III.2.5. Kết quả thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm...................................................75

III.2.6. Khảo sát độ nhạy của phƣơng pháp PCR-RDB............................................77

III.2.7. Kết quả phát hiện đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh .........................78

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................................................80

IV.1. KẾT LUẬN ..............................................................................................................80

IV.2. ĐỀ NGHỊ..................................................................................................................80

TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................................81

PHỤ LỤC.................................................................................................................................91

Trang v

1 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1. Thông tin chung:

- Tên đề tài: “Kết hợp phƣơng pháp PCR và Reverse Dot Blot

phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu

bệnh phẩm gây bệnh cho con ngƣời”.

- Sinh viên thực hiện 1 (Nhóm trƣởng): NGUYỄN TRỌNG NGHĨA

- Lớp: SH10A3 Khoa: CNSH Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

- Sinh viên thực hiện 2: DƢƠNG NGỌC HUỲNH

- Lớp: DH11SH02 Khoa: CNSH Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

- Sinh viên thực hiện 3: NGUYỄN HOÀNG ANH TUẤN

- Lớp: DH11SH01 Khoa: CNSH Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

- Sinh viên thực hiện 4: VÕ THẮNG THƢỞNG

- Lớp: DH11SH02 Khoa: CNSH Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

- Sinh viên thực hiện 5: LÊ THỊ TỐ QUYÊN

- Lớp: SH10A3 Khoa: CNSH Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

- Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

2. Mục tiêu đề tài:

Xây dựng quy trình phát hiện 12 tác nhân vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột bằng kỹ

thuật PCR kết hợp lai phân tử (Reverse dot blot) sử dụng vùng trình tự 16 -23S rDNA,

nhằm t m ra phƣơng pháp chẩn đoán nhanh, chính xác các tác nhân vi khuẩn gây bệnh

thƣờng gặp trong các mẫu bệnh phẩm.

3. Tính mới và sáng tạo:

Chúng tôi kết hợp phƣơng pháp PCR và lai ngƣợc dòng (PCR-Reverse Dot

Blot) để phát hiện các tác nhân vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột. Cho đến nay có rất ít

các công bố khoa học trong nƣớc ứng dụng những kỹ thuật này trong việc phát hiện

Trang vi

các tác nhân vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung, nhóm vi khuẩn gây bệnh

đƣờng ruột nói riêng. Phƣơng pháp mới này khắc phục những hạn chế của những

phƣơng pháp phân tích truyền thống (tiêu tốn thời gian, độ chính xác, khó phát hiện

đồng thời trong cùng một thời gian,...).

4. Kết quả nghiên cứu:

Nhóm sinh viên chúng tôi đã khảo sát thông số vật lý, độ đặc hiệu, độ nhạy của

2 bộ mồi chung (universal primer) và 12 mẫu dò chuyên biệt nhằm phát hiện 12 loài

vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột. Đồng thời nhóm sinh viên đã đạt đƣợc một số kết quả

đáng ghi nhận:

− Thực hiện phản ứng PCR – RDB trên các mẫu DNA của vi khuẩn đối chứng.

Chúng tôi đã thực hiện thành công trên 7 chủng vi khuẩn đối chứng: Bacillus

cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria

monocytogenes, Vibrio parahaelyticus, Yersinia enterocolitica.

− Áp dụng quy trình PCR – RDB trên 15 mẫu bệnh phẩm máu (chai cấy máu đã

đƣợc xác định tác nhân vi khuẩn gây nhiễm bằng phƣơng pháp vi sinh thƣờng

quy ở bệnh viện). Chúng tôi ghi nhận 6/15 mẫu đƣợc phát hiện nhiễm chủng vi

khuẩn Staphylococcus aureus, kết quả này hoàn toàn trùng khớp với kết quả xét

nghiệm truyền thống.

5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc

phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

− Đề tài nghiên cứu đã hoàn thiện việc xây dựng quy trình phát hiện nhanh, nhạy

và xác định chính xác các vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột. Đề tài có ý nghĩa

trong công tác xét nghiệm, kiểm nghiệm các bệnh truyền nhiễm do tác nhân vi

khuẩn gây nên cũng nhƣ trong công tác phòng chống ngộ độc thực phẩm.

− Áp dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm trong thực tế, ghi nhận tính đặc hiệu, độ

nhạy và độ chính xác của quy trình PCR-Reverse dot blot với 2 bộ mồi và 12

mẫu dò chuyên biệt của 12 vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột.

6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài:

Trang vii

Ngày 7 tháng 4 năm 2014

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

Nguyễn Trọng Nghĩa

 Nhận xét của ngƣời hƣớng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh

viên thực hiện đề tài:

Nhóm sinh viên thực hiện đề tài, do sinh viên Nguyễn Trọng Nghĩa làm trƣởng

nhóm đã hoàn thành tốt nội dung nghiên cứu do giảng viên hƣớng dẫn đề nghị trong

giai đoạn kế thừa những kết quả nghiên cứu tiền đề của các sinh viên cùng nhóm năm

2013. Kết thúc giai đoạn này, các sinh viên đã thực hiện việc xác định thông số vật lý,

độ đặc hiệu, độ nhạy của 2 bộ mồi chung (universal primer) và 12 mẫu dò chuyên biệt

nhằm phát hiện 12 loài vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột. Đồng thời nhóm sinh viên đã

đạt đƣợc một số kết quả đáng ghi nhận:

- Xác định tính đặc hiệu của 2 bộ mồi và 12 mẫu dò trên 7 chủng vi khuẩn:

Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria

monocytogenes, Vibrio parahaelyticus, Yersinia enterocolitica.

- Xác định độ nhạy của quy trình PCR-Reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm.

− Áp dụng thành công quy trình PCR-Reverse dot blot trên 15 mẫu bệnh phẩm

(chai cấy máu) thu thập đƣợc tại thành phố Hồ Chí Minh. Nhóm sinh viên thực

hiện quy trình PCR – RDB trên 15 mẫu bệnh phẩm máu (chai cấy máu) đã

đƣợc xác định tác nhân vi khuẩn gây nhiễm bằng phƣơng pháp vi sinh thƣờng

quy ở bệnh viện. Kết quả ghi nhận 6/15 mẫu đƣợc phát hiện nhiễm chủng vi

khuẩn Staphylococcus aureus, kết quả này hoàn toàn trùng khớp với kết quả xét

nghiệm truyền thống.

Trang viii

Ngày 07 tháng 4 năm 2014

Xác nhận của đơn vị Ngƣời hƣớng dẫn

ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

Trang ix

1 THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC

HIỆN ĐỀ TÀI

I. SƠ LƢỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: NGUYỄN TRỌNG NGHĨA

Sinh ngày: 26 tháng 12 năm 1992

Nơi sinh: Xã Mỹ Cát, Huyện Phù Mỹ, Tỉnh B nh Định

Lớp: SH10A3 Khóa: 2010 - 2014

Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Địa chỉ liên hệ: 40/1 Đƣờng Số 7 Khu phố 4, Phƣờng Linh Xuân, Quận Thủ

Đức, TP. HCM.

Điện thoại: 0937216635 Email: [email protected]

II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

Năm thứ 1:

Ngành học: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá

Sơ lƣợc thành tích:

* Năm thứ 2:

Ngành học: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá

Sơ lƣợc thành tích:

Năm thứ 3:

Ngành học: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá

Sơ lƣợc thành tích:

Ngày 07 tháng 4 năm 2014

Xác nhận của đơn vị Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

Nguyễn Trọng Nghĩa