Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích tái sinh chủng loài các Gen nrLSU, nrSSU, Rpb1, Tef1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ

SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN

TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI CÁC GEN

nrLSU, nrSSU, Rpb1, Tef1.

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. LAO ĐỨC THUẬN

SVTH: TRỊNH VĂN HẠNH

MSSV: 1153010217

Khóa: 2011-2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến khoa Công Nghệ

Sinh Học, quý thầy cô, những người bạn đã luôn ở bên, đã giúp đỡ Tôi trong những

lúc khó khăn khi thực hiện đề tài này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy, người đã

dìu dắt, truyền cho Tôi niềm đam mê làm nghiên cứu, giúp đỡ, định hướng cho Tôi

trong suốt thời gian thực tập và làm khóa luận tốt nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn ThS. Lao Đức Thuận và ThS. Trương Kim Phượng,

người luôn sẵn lòng giúp đỡ, góp ý và đưa ra những lời khuyên bổ ích cho Tôi để

Tôi có thể trau dồi thêm kinh nghiệm cần thiết trong công việc làm nghiên cứu.

Cảm ơn bạn bè và tất cả các bạn phụ việc trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử

đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên Tôi trong những lúc khó khăn trong thời gian thực

hiện đề tài.

Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ, người đã nuôi

dưỡng, yêu thương, chăm sóc, động viên tạo điều kiện tốt nhất cho con thực hiện

ước mơ của mình.

Bình Dương, ngày 05 tháng 05 năm 2015

Trịnh Văn Hạnh

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Trịnh Văn Hạnh Trang i

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cordyceps sinesis ở ngoài tự nhiên (Tây Tạng, Trung Quốc)

Hình 1.2. Cấu trúc gen và vị trí mồi NS1/NS4 khuyếch đại vùng gen nrSSU

Hình 1.3. Sơ đồ vị trí các vùng domain thuộc trình tự gen nrLSU

Hình 1.4. Chức năng của vùng CTD thuộc gen Rpb1

Hình 1.5. Cấu trúc và cặp mồi khuyếch đại gen Tef1

Hình 1.6. Sơ đồ biểu diễn của vách tế bào nấm

Hình 2.1. Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0038A

Hình 2.2. Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0038B

Hình 2.3. Hình thái giải phẩu mẫu nấm DL0067

Hình 2.4. Hình thái giải phẩu nấm DL0069

Hình 2.5. Hình thái giải phẩu mẫu nấm DL0075

Hình 3.1. Kết quả sắp gióng cột của mồi xuôi LR0R với trình tự gen nrLSU

Hình 3.2. Kết quả sắp gióng cột của mồi ngược LR5 với trình tự gen nrLSU

Hình 3.3. Kết quả Annhyb cặp mồi LR0R và LR5 trên trình tự gen nrLSU

Hình 3.4. Kết quả kiểm tra mồi LR0R/LR5 bằng BLAST trên GenBank

Hình 3.5. Kết quả Annhyb cặp mồi NS1/NS4 với trình tự gen nrSSU

Hình 3.6. Kết quả BLAST cặp mồi NS1/NS4 khuếch đại gen nrSSU

Hình 3.7. Kết quả kiểm tra mồi Crpb1/ Rpb1Cr bằng BLAST trên NCBI

Hình 3.8. Mồi xuôi CRPB1 được sắp gióng cột với các trình tự Rpb1 của các loài

trong chi Cordyceps (Y = C/T, W = A/T, R = A/G)

Hình 3.9. Mồi xuôi RPB1Cr được sắp gióng cột với các trình tự Rpb1 của các loài

trong chi Cordyceps

Hình 3.10. Sử dụng Annhyb để kiểm tra vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩm với

Cordyceps militaris

Hình 3.11. Kết quả kiểm tra cặp mồi 983F/2218R trên công cụ BLAST

Hình 3.12. Kết quả Annhyb cặp mồi 983F/2218R với trình tự gen Tef1

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Trịnh Văn Hạnh Trang ii

Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen nrLSU, nrSSU tách chiết theo

phương pháp phenol/chloroform không bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB

Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen nrLSU, nrSSU, Tef1 tách chiết theo

phương pháp phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen Rpb1 tách chiết theo phương pháp

phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB

Hình 3.16. Hiệu chỉnh tín hiệu nhiễu ở đầu mạch xuôi của nrLSU

Hình 3.17. Vị trí sai lệch của hai kết quả giải trình tự ở đầu mạch xuôi của nrLSU

Hình 3.18. Hiệu chỉnh ở vùng giữa trên 2 mạch của gen nrLSU

Hình 3.19. Hiệu chỉnh vùng 3, vùng 4 trên mạch xuôi nrLSU

Hình 3.20. Hiệu chỉnh vùng cuối mach xuôi nrLSU

Hình 3.21. Hiệu chỉnh vùng 3’ trên mạch xuôi của nrLSU

Hình 3.22. Hình kết quả BLAST trình tự gen nrLSU mạch xuôi đã hiệu chỉnh

Hình 3.23. Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum

likelihoood dựa trên gen nrLSU (các con số hiển thị trên cây là giá trị bootstrap của

1000 lần lặp lại)

Hình 3.24. Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum

likelihoood dựa trên gen nrSSU (các con số hiển thị trên cây là giá trị bootstrap của

1000 lần lặp lại)

Hình 3.25. Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum

likelihoood dựa trên gen Rpb1 (các con số hiển thị trên cây là giá trị bootstrap của

1000 lần lặp lại)

Hình 3.26. Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum

likelihoood dựa trên gen Tef1 (các con số hiển thị trên cây là giá trị bootstrap của

1000 lần lặp lại)

Hình 3.27. Cây phả hệ phân tử đa gen được xây dựng bằng phương pháp Maximum

Likelihood dựa trên gen nrLSU, nrSSU, Tef1, Rpb1 (các con số hiển thị trên cây là

giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại)

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Trịnh Văn Hạnh Trang iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Bảng các mồi sử dụng trong thực nghiệm

Bảng 3.1. Thông tin về trình tự và các thông số vật lý đánh giá của các cặp mồi

nhằm khuếch đại gen nrLSU, nrSSU, Tef1, Rpb1

Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 3 mẫu nấm ký

sinh côn trùng được tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform

Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra DNA bằng mật độ quang phổ kế các mẫu nấm tách chiết

có bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB.

Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả hiệu chỉnh trình tự các mẫu nấm ký sinh côn trùng

Bảng 3.5. Kết quả chiều dài các trình tự trước và sau hiệu chỉnh

Bảng 3.6. Kết quả đồng bộ khối dữ liệu dựng cây phát sinh loài đơn và đa gen

Bảng 3.7. Kết quả dò tìm mô hình tiến hóa của các gen nrLSU, nrSSU, Rpb1, Tef1

và đa gen

Bảng 3.8. Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử đơn gen

Bảng 3.9. Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử đa gen

nrLSU, nrSSU, Rpb1, Tef1

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Trịnh Văn Hạnh Trang iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AICc Akaike Information Content

BIC Bayesian Information Content

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

BP Base-Pair

CTAB Cetyltrimethyl Ammonium Bromide

DNA Deoxyribonucleic Acid

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FtsZ Filamenting temperature-sensitive mutant Z

GTR General time reverible model

ITS Internal Transcribed Spacer

ML Maximum Likelihood

MP Maximum parsimony

NCBI National Center for Biotechnology Information

NJ Neighber-Joining

Nu Nucleotide

PCR Polymerase Chain Reaction

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

RNA Ribonucleic Acid

rRNA ribosomal Ribonucleic Acid

SDS Sodium dodecyl sulfate

SSU Small Subunit

TEF-1α The Elongation Factor 1 alpha

Tub Tubulin

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic

Mean

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Trịnh Văn Hạnh Trang v

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH.......................................................................................i

DANH MỤC BẢNG....................................................................................iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................iv

MỤC LỤC .................................................................................................... v

ĐẶT VẤN DỀ............................................................................................... 1

PHẦN 1. TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ THÀNH PHẦN LOÀI..................................................4

1.1.1. Đặc điểm chung ..................................................................................4

1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và thành phần loài ................................................5

1.2. ỨNG DỤNG CỦA NẤM KÝ SINH TRONG SINH HỌC....................................6

1.2.1. Kiểm soát bệnh hại do côn trùng .........................................................7

1.2.2. Ứng dụng trong lĩnh vực y dược..........................................................7

1.3. ĐẶC ĐIỂM NHẬN DẠNG VÀ ĐỊNH DANH.......................................................9

1.3.1. Định danh phân tử.............................................................................11

1.3.2. Nhóm gen giữ nhà (house keeping gene) trong định danh phân tử các

loài nấm......................................................................................................12

1.4. XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH LOÀI ĐA GEN ................................................17

1.5. NGUYÊN TẮC TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN DNA Ở LOÀI NẤM............18

1.6. KI THUẬT PCR VA GIẢI TRINH TỰ...............................................................20

1.6.1. Kĩ thuật PCR.....................................................................................20

1.6.2. Giải trình tự.......................................................................................20

1.7. PHẢ HỆ PHÂN TỬ................................................................................................21

1.7.1. Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài .................................21

1.7.2. Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh chủng loài[6] ............22

1.8. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC ....................................................29

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU......................................................32

2.1.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................32

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Trịnh Văn Hạnh Trang vi

2.1.2. Danh mục các phần mền sử dụng ......................................................38

2.1.3. Tiến trình nghiên cứu ........................................................................39

2.1.4. Khảo sát in silico...............................................................................40

2.1.5. Tiến hành thực nghiệm......................................................................41

PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐÁNH GIÁ MỒI TRÊN IDT................................................................................47

3.1.1. Kết quả kiểm tra mồi bằng BLAST và ClustalW, Annhyb của các cặp

mồi .............................................................................................................49

3.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM.................................................................................59

3.2.1. Xây dựng quy trình thực nghiệm khuếch đại gen nrLSU, nrSSU, Tef1,

Rpb1 cho các mẫu nấm ký sinh côn trùng ...................................................59

3.2.2. Kết quả hiệu chỉnh trình tự................................................................63

3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH PHÂN TỬ ....................................................................69

3.3.1. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA.......................................................69

3.3.2. Xây dựng cây phát sinh loài phân tử .................................................69

3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH HÌNH THÁI KẾT HỢP VỚI ĐỊNH DANH

PHÂN TỬ.......................................................................................................................83

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 87

PHỤ LỤC

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Trịnh Văn Hạnh Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Loài nấm ký sinh côn trùng, tiêu biểu có Cordyceps sinensis thuộc họ

Clavicipitaceae chứa nhiều thành phần hoạt chất quan trọng, có nhiều ứng dụng to

lớn trong y học, chẳng hạn (1) ức chế sự phát triển của khối u (Bok. et. al., 1999)[1];

(2) điều hòa quá trình đáp ứng miễn dịch (Kuo. et. al., 1996)[5]; (3) tăng cường chức

năng gan (Manabe. et. al., 1996)… Hiện nay, nghiên cứu không chỉ tập trung vào

loài Cordyceps sinensis mà còn mở rộng nghiên cứu đến nhiều loài thuộc họ

Clavicipitaceae, điều ngạc nhiên là các loại này đều có hoạt tính y dược. Điều quan

trọng để ứng dụng các tính chất của các loài nấm trong y học là tiên quyết phải biết

rõ tên loài và đặc điểm của chúng. Hiện nay việc định danh các loại nấm thuộc họ

này đều dựa trên kỹ thuật phân tích hình thái theo Kobayashi (1982)[21]

. Mặc dù kỹ

thuật này được xem như là tiêu chuẩn vàng trong định danh, tuy nhiên kỹ thuật này

vẫn còn gặp nhiều khó khăn do các đặc điểm, cấu trúc của các loài nấm thuộc họ

Clavicipitaceae. Một số các khó khăn làm ảnh hưởng đến kết quả định danh dựa trên

phân tích hình thái có thể kể là: (1) Nấm là đối tượng có cấu trúc cơ thể khá đơn

giản nhưng lại có thành phần loài rất phong phú, đặc biệt chúng có khả năng biến

đổi theo điều kiện của môi trường, dẫn đến sự thay đổi về màu sắc, hình dạng, kích

thước, dạng quả thể… trong cùng một loài là rất lớn; (2) Chúng tồn tại ở hai thể: vô

tính (anamorph) và hữu tính (teleomorph), chẳng hạn theo tổng kết của Sung. et. al.,

(2007) trong họ Clavicipitaceae các loài có thể hữu tính (teleomorph) thuộc về các

chi Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella có thể chính là các loài

có thể vô tính thuộc về các chi Aschersonia, Metarhizium, Nomuraea, Paecilomyces,

Pochonia, Rotiferophthora, Verticillium[6]. Do đó, hiện nay các nghiên cứu ngoài

việc sử dụng kỹ thuật định danh truyền thống, phần lớn đều ứng dụng kỹ thuật sinh

học phân tử vào công tác định danh[1]. Điều đáng lưu ý là từ năm 1995, sinh học

phân tử đã góp phần tích cực trong việc giải quyết một cách hữu hiệu những tồn tại

về mối quan hệ giữa thể vô tính và hữu tính, xác định chính xác loài và hệ thống

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Trịnh Văn Hạnh Trang 2

chủng loại của nhóm nấm này. Hơn nữa, trên ngân hàng gen, cơ sở dữ liệu được

công bố cho nấm nói chung và cho họ Clavicipitaceae.

Theo nghiên cứu của Sung. et. al., (2007) đã sắp xếp lại hệ thống nhóm nấm

Cordyceps cũng như họ Clavicipitaceae dựa trên việc phân tích các dữ liệu từ 5 - 7

gen thuộc nhóm gen giữ nhà (house keeping gene) bao gồm: nrSSU (nuclear

ribosomal small subunit - tiểu đơn vị nhỏ ribosome), nrLSU (nuclear ribosomal large

subunit - tiểu đơn vị lớn ribosome), Tef1 (elongation factor 1α - nhân tố kéo dài 1α),

Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II - tiểu đơn vị lớn nhất của

RNApolymerase II), Rpb2 (second largest subunit of RNA polymerase II - tiểu đơn

vị lớn thứ hai của RNA polymerase II), Tub (β tubulin) và Atp6 (mitochondrial

ATP6) của 162 taxon[7]. Kết quả nghiên cứu này rất phù hợp với các phân tích bằng

hình thái giải phẫu. Qua công trình này, các tác giả đã khẳng định các loài thuộc

nhóm nấm này nên được chia thành 3 họ là họ Clavicipitaceae với các chi

Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella; họ Cordycipitaceae với chi

Cordyceps; họ Ophiocordycipitaceae với 2 chi Ophiocordyceps và

Elaphocordyceps[38]

.

Bên cạnh đó thì Tang. et. al., (2007) đã sử dụng gen nrSSU, nrLSU, Rpb2, Tub (β

tubulin) để tiến hành xây dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen với mục đích

phân loại các chi trong họ Sordariomycetes (một lớp nấm thuộc ngành nấm túi

Ascomycota) [8]. Nhóm tác giả đã tiến hành dựng cây đơn gen đối với 4 gen trên và

nối gen nrLSU+nrSSU và nrLSU+nrSSU+Rpb2…và nhận thấy một vài điểm như

sau: (1) cây phát sinh loài của gen nrSSU thể hiện mức độ tin cậy cao hơn, mối quan

hệ giữa các chi được thể hiện rỏ ràng hơn so với cây phát sinh loài của gen nrLSU và

Rpb2; (2) cây phát sinh loài dựa vào gen nrSSU là cây đáng tin cậy và có ý nghĩa về

mặt thống kê, tuy nhiên khi kết hợp cả gen nrSSU với nrLSU hoặc nrLSU+Rpb2 thì

các nhánh trong cây có mức ý nghĩa của cây khá cao (dựa vào Bayesian và giá trị

bootstrap), gen Tub kết hợp với gen nrLSU và Rpb2 cũng cho kết quả khá khả quan;

(3) khi kết hợp các gen thì làm gia tăng số lượng các nucleotide kết hợp trong dữ

liệu cục bộ, một hướng giải quyết cho cây phát sinh loài[8]. Ngoài ra nhóm tác giả

Khóa luận tốt nghiệp

SVTH: Trịnh Văn Hạnh Trang 3

Nonaka. et. al., đã tách chiết và khuếch đại thành công các trình tự gen nrSSU,

nrLSU, Tef1, Rpb1, Rpb2, ITS mong muốn đồng thời cũng tiến hành xây dựng cây

phát sinh loài nhằm tiến tới định danh ba phân loài mới của Pochonia được phân lập

từ đất ở Nhật Bản[6].

Từ những thông tin về cây phát sinh loài đa gen, việc phân tích dữ liệu các gen

giữ nhà là cần thiết để hỗ trợ trong việc định danh loài nấm ký sinh côn trùng. Sự kết

hợp đa gen góp phần hỗ trợ là tăng mức độ tin cậy của cây phát sinh loài. Từ đó, tôi

tiến hành thực hiện đề tài: “Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng

dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các gen nrLSU, nrSSU, Tef1, Rpb1”.