Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi nấm kí sinh côn trùng dựa trên cơ sở dữ liệu phả hệ phân tử và cấu trúc bậc hai của vùng trình tự ITS1-5.7S-ITS2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC LOÀI NẤM

THUỘC CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

DỰA TRÊN CƠ SỞ DỮ LIỆU PHẢ HỆ PHÂN TỬ

VÀ CẤU TRÚC BẬC HAI CỦA VÙNG TRÌNH TỰ

ITS1-5.8S-ITS2

Thuộc nhóm nghành khoa học: Sinh Học Phân Tử

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC LOÀI NẤM

THUỘC CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

DỰA TRÊN CƠ SỞ DỮ LIỆU PHẢ HỆ PHÂN TỬ

VÀ CẤU TRÚC BẬC HAI CỦA VÙNG TRÌNH TỰ

ITS1-5.8S-ITS2

Thuộc nhóm nghành khoa học: Sinh Học Phân Tử

Sinh viện thực hiện: Đỗ Ngọc Nam Giới tính: Nam

Dân tộc: Kinh

Lớp: SH09A3, Công Nghệ Sinh Học Năm thứ 4/ Số năm đào tạo: 4 năm

Nghành học: Công Nghệ Sinh Học

Người hướng dẫn: PGS. TS Lê Huyền Ái Thuý

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN

CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I. SƠ LƢỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Đỗ Ngọc Nam

Sinh ngày: 14 tháng 08 năm 1991

Nơi sinh: Krong Pak – Dak Lak

Lớp: SH09A3 Khóa: 2009 - 2013

Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Địa chỉ liên hệ:

Điện thoại: 01667580705 Email: [email protected]

II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP:

* Năm thứ 1:

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá

Sơ lược thành tích:

* Năm thứ 2:

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá

Sơ lược thành tích:

Ảnh 4x6

* Năm thứ 3:

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Kết quả xếp loại học tập: Khá

Sơ lược thành tích:

* Năm thứ 4:

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Kết quả xếp loại học tập: Khá

Sơ lược thành tích:

Ngày tháng năm

Xác nhận của đơn vị

(ký tên và đóng dấu)

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1. Thông tin chung:

- Sinh viên thực hiện: Đỗ Ngọc Nam Nam, Nữ: Nam

- Dân tộc: Kinh

- Lớp, khoa: Khóa 2009-Khoa CNSH Năm thứ: 4 /Số năm đào tạo:4

- Ngành học: Chuyên ngành Vi sinh-Sinh học phân tử

- Người hướng dẫn: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

2. Mục tiêu đề tài:

Mục tiêu lớn của đề tài là giúp định danh chính xác bộ sưu tập các loài thuộc chi

nấm ký sinh côn trùng.

Trong khuôn khổ đề tài NCKH của sinh viên, mục tiêu đề tài chỉ tóm gọn lại mục

tiêu lớn nói trên, tập trung trên việc xây dựng phương pháp luận hoàn chỉnh dựa trên kỹ

thuật Sinh học Phân tử kết hợp Tin-Sinh học ứng dụng nhằm hỗ trợ định danh một số mẫu

nấm ký sinh côn trùng.

3. Tính mới và sáng tạo:

Với sự hạn chế về mặt kinh phí thực hiện, chỉ có được thông tin di truyền của một

vùng gen ITS1-5.8S-ITS2, chúng tôi đã vận dụng thành công việc khai thác thông tin này:

trình tự của cấu trúc bậc 1, và cấu trúc bậc 2 vùng ITS2 để hỗ trợ tối đa cho công tác định

danh các mẫu nấm có được.

4. Kết quả nghiên cứu:

Phương pháp luận đã được xây dựng tổng thể, toàn bộ: từ thực nghiệm cho đến

trên máy tính. Các khâu như tách chiết DNA, PCR, giải trình tự đã được quy trình hóa với

các ghi chú quan trọng, cần thiết.

Các bước hiệu chỉnh trình tự sau giải, xây dựng cơ sở dữ liệu cục bộ tin cậy, khai

thác cơ sỡ dữ liệu Genbank, xây dựng các phả hệ phân tử bằng cả 4 phương pháp, xây

dựng cấu trúc bậc 2, đều được chúng tôi áp dụng theo đúng quy chuẩn thế giới.

Kết quả vì vậy, hỗ trợ định danh đạc mức độ chính xác rất cao. Số mẫu đã xác định

được đến mức loài, hay mức chi đều đã có kết luận rõ ràng, cung cấp thông tin cần thiết

cho việc khai thác các ứng dụng chi nấm này hay hỗ trợ tiếp tục cho công tác phân loại

vẫn đang được tiếp tục tiến hành.

5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả

năng áp dụng của đề tài:

Tuy chỉ mới là kết quả thực nghiệm bước đầu, nhưng chúng tôi hoàn toàn có đầy đủ

cơ sở khoa học để sẽ tiếp tục nghiên cứu ở mức cao hơn, tăng cỡ mẫu thực hiện của bộ

sưu tập lên đến hơn 100 mẫu. Phương pháp luận xây dựng được qua nghiên cứu này hoàn

toàn đủ cơ sở để áp dụng cho các chi nấm khác.

6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ tên tạp chí

nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có):

Ngày tháng năm

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên

thực hiện đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

Nhóm sinh viên thực hiện đề tài, do SV. Nguyễn Ngọc Nam làm trưởng nhóm đã

hoàn thành tốt công việc do GV hướng dẫn đề nghị trong giai đoạn đầu thực hiện đề tài.

Kết thúc giai đoạn này, các em đã cung cấp các số liệu khai thác thông tin (data mining)

khá hoàn để xây dựng cơ sỡ dữ liệu cục bộ, phục vụ mục tiêu phân loại định danh nấm

sau này. Các ghi chú thực nghiệm cũng rất quan trọng khi tiến hành với nấm ký sinh đã

được rút ra. Các phương pháp sử dụng đều mang quy chuẩn thế giới, chính vì vậy .

phương pháp luận được xây dựng hoàn chỉnh là kết quả nổi bậc nhất của đề tài. Đề tài sẽ

được tiếp tục mở rộng để định danh cho bộ sưu tập lên đến 100 mẫu đã có.

Ngày tháng năm

Xác nhận của đơn vị

(ký tên và đóng dấu)

Người hướng dẫn

(ký, họ và tên)

LỜI CÁM ƠN

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành tốt đề tài này, cùng với sự phấn đấu và cố gắng hết mình, em đã

nhận đƣợc sự hƣớng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, gia đình và bạn bè.

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh

Học, trƣờng đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức nền

tảng vô cùng quý giá, tạo tiền đề để em tiếp tục học tập, nghiên cứu. Em xin gửi lời

cảm ơn chân thành nhất đến cô Lê Huyền Ái Thúy và anh Trần Huỳnh Minh Nhật,

cảm ơn thầy cô luôn bên cạnh định hƣớng, truyền đạt kinh nghiệm, động viên em hoàn

thành đề tài.

Xin cảm ơn các bạn cùng thực tập và các em đang học việc tại phòng thí

nghiệm đã hỗ trợ, giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài thực thập này.

Và cuối cùng, con xin đƣợc gửi lời cám ơn đến ba mẹ đã luôn động viên hỗ trợ

con hết mình để con có đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Con xin chúc ba mẹ lời chúc sức

khỏe.

Một lần nữa em xin gửi đến quý thầy cô, các anh chị, các bạn và các em lời biết

ơn và lời kính chúc sức khỏe, gặt hái nhiều thành công trong tƣơng lai.

Em xin chân thành cảm ơn

Tp. Hồ Chí Minh,tháng 04 năm 2013

Đỗ Ngọc Nam

Nguyễn Thị Hải Ngọc

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1.................................................................................................................... 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................................. 4

1.1. T ỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG: .......................... 5

1.1.1. Đặc điểm chung và thành phần loài ........................................................... 5

1.1.2. Phân loại khoa học:..................................................................................... 5

1.1.3. Tiềm năng ứng dụng:.................................................................................. 6

1.2. NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI: ......................................... 8

1.2.1. Đặc điểm nhận dạng và định danh: ............................................................ 8

1.2.2. DNA ribosome và trình tự ITS trong định danh phân tử nấm: .................. 9

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC:..................................................... 14

1.4. KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ: ............................................................................. 15

1.4.1. Phƣơng pháp Maxam – Gilbert: ............................................................... 16

1.4.2. Phƣơng pháp Sanger hay dideoxynucleotide: .......................................... 17

1.4.3. Những phƣơng pháp cải tiến của phƣơng pháp Sanger: .......................... 19

1.4.4. Pyrosequencing......................................................................................... 20

1.5. HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ (PROOFREADING) .................................................. 20

1.6. NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH LOÀI ................................................................ 22

1.7. DỰ ĐOÁN CẤU TRÚC BẬC HAI rDNA............................................................ 26

CHƢƠNG 2.................................................................................................................. 29

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 29

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ....................................................... 30

2.2. Vật liệu vá phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................... 30

2.2.1. Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng................................................................. 30

2.2.2. Dụng cụ - thiết bị - hoá chất ..................................................................... 30

2.2.3. Danh mục các phần mềm sử dụng............................................................ 31

2.3. TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU:............................................................................... 32

2.3.1. Thu thập mẫu và sơ bộ định danh hình thái: ............................................ 33

2.3.2. Tách chiết DNA tổng số từ hệ sợi: ........................................................... 33

2.3.3. PCR........................................................................................................... 34

MỤC LỤC

2.3.4. Xác định trình tự đã khuếch đại: .............................................................. 35

2.3.5. Hiệu chỉnh trình tự:................................................................................... 35

2.3.6. So sánh với cơ sở dữ liệu GenBank: ........................................................ 36

2.3.7. Xây dựng bộ dữ liệu DNA: ...................................................................... 36

2.3.8. Dò tìm mô hình tiến hoá:.......................................................................... 36

2.3.9. Xây dựng cây phát sinh loài: .................................................................... 37

2.3.10. Dự đoán cấu trúc bậc hai vùng gene ITS2 ............................................. 37

2.3.11. Xử lý hình ảnh: ....................................................................................... 37

CHƢƠNG 3.................................................................................................................. 38

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................................... 38

3.1. KẾT QUẢ SƢU TẬP MẪU VÀ SƠ BỘ ĐỊNH DANH HÌNH THÁI.................. 39

3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM NHẰM KHUẾCH ĐẠI VÙNG

ITS1-5.8S-ITS2 CHO CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG:........................ 39

3.3. KẾT QUẢ HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ................................................................... 44

3.3.1. Kết quả hiệu chỉnh trình tự với SeaView và Chromas Pro: ..................... 44

3.4. PHÂN TÍCH THÀNH PHẨN NUCLEOTIDE Ở VÙNG ITS1-5.8S-ITS2:......... 49

3.5. KẾT QUẢ SO SÁNH VỚI CƠ SỞ DỮ LIỆU GENBANK:................................. 51

3.6. XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU TRÌNH TỰ ITS NHÓM NẤM KÝ SINH

CÔN TRÙNG............................................................................................................. 55

3.7. XÁC ĐỊNH MÔ HÌNH TIẾN HOÁ: ..................................................................... 55

3.8. KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH LOÀI: ............................................. 56

3.9. KẾT QUẢ DỰ ĐOÁN CẤU TRÚC BẬC HAI VÙNG ITS2:.............................. 62

3.10. PHÂN TÍCH CÁC KẾT QUẢ - KẾT LUẬN VỀ PHÂN LOẠI, ĐỊNH DANH

CHO CÁC MẪU NẤM THUỘC BỘ SƢU TẬP : .................................................... 63

CHƢƠNG 4.................................................................................................................. 81

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................... 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 84

PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 88

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ATP : Adenosine triphosphate

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

bp : base-pair

CTAB : Cetyl Trimethylammonium Bromide

ddNTP : dideoxynucleotide triphosphate

DNA : deoxyribonucleotide

dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

ETS : external transcribed spacer

IGS : intergenic spacer

ITS : internal transcribed spacer

LSU : large subunit

MP : maximum parsimony

ML : maximum likelihood

NJ : neighbor-joining

NTS : non-transcribed spacer

PCR : polymerase chain reaction

PCR-SSCP : PCR-based single-stranded comformational

rDNA : ribosomal DNA

RAPD : randomly amplified polymorphism DNA

RFLP : restriction fragmnet length polymorphism

RNA : ribonucleic acid

rRNA : ribosomal RNA

SDS : Sodium dodecyl sulfate

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

SSU : small subunit

TAE : Tris-acetate-EDTA

TE : Tris-EDTA

THUẬT NGỮ ANH – VIỆT:

Anamorph: thể vô tính

Automated base-calling: đọc base tự động

Consensus sequence: trình tự bảo tồn của hai hay nhiều trình tự

Homology: sự tƣơng đồng giữa các đối tƣợng (theo nghĩa cùng một tổ tiên chung)

Isolate: loài phân lập

Mismatch: bắt cặp sai, sai lệch

Proofreading: hiệu chỉnh trình tự

Sequencing: đọc trình tự, giải trình tự, xác định trình tự

Similarity: sự tƣơng đồng (mang tính định lƣợng từ so sánh các chỉ tiêu thực nghiệm)

Telomorph: thể hữu tính

Topology: địa hình học

CÁC DANH MỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

ản ứng và tác nhân hoá học đƣợc sử dụng để tách các base một

cách chuyên biệt trong phƣơng pháp Maxam-Gilbert ............................................ 16

ự các mồi sử dụng trong phản ứng PCR...................................... 34

Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 5 mẫu nấm ký

sinh côn trùng đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp phenol:chloroform.................. 39

ết quả kiểm tra mật độ quang lần hai bằng tỷ số OD260/ 230 và

OD260/ 280 các mẫu nấm đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp phenol:chloroform41

ết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế các mẫu nấm đƣợc tách

chiết theo phƣơng pháp CTAB .................................................................................. 42

ết quả hiệu chỉnh trình tự các mẫu nấm ký sinh côn trùng ................ 47

ự biến động về chiều dài và thành phần G+C của vùng ITS1 và ITS250

ết quả so sánh trình tự ITS đã hiệu chỉnh với các trình tự trên

GenBank....................................................................................................................... 52

: Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử và hình

thái................................................................................................................................. 78