Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng bằng phân tích phát sinh chủng loài dựa trên vùng Gen nrLSU và Rpb1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ

SINH CÔN TRÙNG BẰNG PHÂN TÍCH

PHÁT SINH CHỦNG LOÀI DỰA TRÊN

VÙNG GEN nrLSU VÀ Rpb1

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: ThS. Lao Đức Thuận

CN. Vũ Tiến Luyện

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo

MSSV: 1153010761

Khóa: 2011 - 2015

Bình Dương, tháng 05 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, ngoài sự cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn của

thầy cô, anh chị và sự giúp đỡ của bạn bè.

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh Học

Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức

nền tảng nhất, em xin cảm ơn thầy Lao Đức Thuận, người đã trực tiếp hướng dẫn

em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành chuyên đề khóa luận tốt nghiệp,

luôn bên cạnh định hướng, truyền đạt kinh nghiệm, động viên em hoàn thành đề tài.

Bên cạnh đó, em cũng xin cảm ơn anh Vũ Tiến Luyện đã luôn nhiệt tình giúp đỡ,

hướng dẫn, chia sẻ cho em nhiều kinh nghiệm giúp em thực hiện tốt đề tài.

Con cảm ơn mẹ và gia đình đã luôn bên con, tạo mọi điều kiện tốt nhất để con hoàn

thành việc học của mình.

Em xin chân thành cảm ơn những anh, chị và các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh

học phân tử Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn quan tâm, giúp

đỡ em trong quá trình làm đề tài.

Một lần nữa, em xin gửi đến tất cả các thầy cô, anh chị, bạn bè lời biết ơn và kính

chúc sức khỏe, may mắn, gặt hái nhiều thành công trong tương lai.

Bình Dương, Ngày 05 tháng 05 năm 2015

SINH VIÊN

Nguyễn Thị Thu Thảo

Danh mục các hình

Hình 1.1. Ophiocordyceps sinensis

Hình 1.2. Cấu trúc của rDNA và vùng gen nrLSU với cặp mồi LR0R/LR5

Hình 1.3. Cấu trúc vùng gen Rpb1

Hình 2.1. Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0038A

Hình 2.2. Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0038B

Hình 2.3. Hình thái giải phẫu nấm DL0069

Hình 2.4. Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0075

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 bằng BLAST (NCBI)

Hình 3.2. Kết quả kiểm tra cặp mồi CRPB1/RPB1Cr bằng BLAST (NCBI)

Hình 3.3. Mồi xuôi LR0R được sắp gióng cột với các trình tự nrLSU của các loài

trong chi Cordyceps

Hình 3.4. Mồi ngược LR5 được sắp gióng cột với các trình tự nrLSU của các loài

trong chi Cordyceps

Hình 3.5. Mồi xuôi CRPB1 được sắp gióng cột với các trình tự Rpb1 của các loài

trong chi Cordyceps

Hình 3.6. Mồi xuôi RPB1Cr được sắp gióng cột với các trình tự Rpb1 của các loài

trong chi Cordyceps

Hình 3.7. Sử dụng Annhyb để kiểm tra vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩm với

Ophiocordyceps coccidiicola

Hình 3.8. Sử dụng Annhyb để kiểm tra vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩm với

Cordyceps militaris

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen nrLSU và Rpb1 tách chiết theo

phương pháp phenol:chloroform

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen nrLSU và Rpb1 tách chiết theo

phương pháp phenol:chloroform bổ sung β-mercaptoethanol

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen nrLSU và Rpb1 tách chiết theo

phương pháp phenol:chloroform bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB

Hình 3.12. Mô tả sự sai khác nu ở hai mạch xuôi và ngược gen nrLSU ở đầu 3‟

Hình 3.13. Hiệu chỉnh vùng tín hiệu bị nhiễu ở một mạch của nrLSU

Hình 3.14. Thể hiện mức độ tương đồng của trình tự hai mạch

Hình 3.15. Vị trí sai lệch của hai kết quả giải trình tự ở đầu mạch xuôi của nrLSU

Hình 3.16. Mô tả sự sai khác nu ở hai mạch xuôi và ngược gen nrLSU ở đầu 5‟

Hình 3.17. Hình kết quả BLAST trình tự nrLSU mạch xuôi đã hiệu chỉnh

Hình 3.18. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen nrLSU bằng

phương pháp Maximum Likelihood

Hình 3.19. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen Rpb1 bằng

phương pháp Maximum Likelihood

Hình 3.20. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen nrLSU kết hợp

với Rpb1 bằng phương pháp Maximum Likelihood

Danh mục các bảng

Bảng 2.1. Trình tự các mồi đánh giá trong đề tài

Bảng 2.2. Các thông số thiết lập cho chu kì nhiệt trong phản ứng PCR khuếch đại

vùng gen nrLSU và Rpb1

Bảng 3.1. Thông tin về trình tự và các thông số vật lí của cặp mồi được sử dụng để

khuếch đại vùng gen nrLSU và Rpb1

Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 4 mẫu nấm ký

sinh côn trùng được tách chiết theo phương pháp phenol:chlloroform

Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 4 mẫu nấm ký

sinh côn trùng được tách chiết theo phương pháp phenol:chlloroform có bổ sung β￾mercaptoethanol

Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 4 mẫu nấm ký

sinh côn trùng được tách chiết theo phương pháp phenol:chlloroform có bổ sung β￾mercaptoethanol và CTAB

Bảng 3.5. Hiệu chỉnh các nu tại các vị trí (1) đến (8)

Bảng 3.6. Tổng hợp kết quả hiệu chỉnh trình tự các mẫu nấm ký sinh côn trùng

Bảng 3.7. Kết quả chiều dài các trình tự trước và sau hiệu chỉnh

Bảng 3.8. Thông tin các trình tự được sử dụng để xây dựng cơ sở dữ liệu vùng gen

nrLSU, Rpb1 sau khi tinh chế

Bảng 3.9. Tổng hợp kết quả dò tìm mô hình tiến hóa bằng chức năng Find Best

DNA/Protein Models (ML) trong phần mềm MEGA 6.06 dựa trên bộ CSDL gen

nrLSU , Rpb1 và nrLSU_Rpb1

Bảng 3.10. Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử và hình

thái

Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về các loài nấm ký sinh công trùng............................................3

1.1.1. Đặc điểm chung và thành phần loài ...........................................................3

1.1.2. Tiềm năng ứng dụng ..................................................................................4

1.2. Nghiên cứu hỗ trợ định danh và phát sinh loài............................................6

1.2.1. Đặc điểm nhận dạng và định danh .............................................................6

1.2.2. Trình tự nrLSU và Rpb1 trong định danh phân tử nấm .............................8

1.3. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc................................................................11

1.4. Kỹ thuật PCR và giải trình tự .....................................................................13

1.4.1. Kỹ thuật PCR ...........................................................................................13

1.4.2. Kỹ thuật giải trình tự ................................................................................14

1.5. Nghiên cứu phát sinh loài.............................................................................14

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng....................................................................21

2.2. Dụng cụ - thiết bị - hóa chất.........................................................................23

2.2.1. Dụng cụ ....................................................................................................23

2.2.2. Thiết bị .....................................................................................................23

2.2.3. Hóa chất....................................................................................................24

2.3. Danh mục các phần mềm sử dụng...............................................................24

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................25

2.4.1. Khảo sát In silico......................................................................................25

2.4.2. Thực nghiệm ............................................................................................26

2.4.3. Phân tích phát sinh loài ............................................................................30

PHẦN 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả đánh giá mồi....................................................................................31

3.1.1. Kết quả đánh giá mồi bằng IDT...............................................................31

3.1.2. Kiểm tra mồi bằng BLAST trên NCBI ....................................................33

3.1.3. Kiểm tra mồi bằng sắp gióng cột với Clustal...........................................35

3.1.4. Kết quả kiểm tra Annhyb .........................................................................36

3.2. Kết quả thực nghiệm.....................................................................................38

3.3. Kết quả hiệu chỉnh trình tự..........................................................................42

3.5. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu............................................................................47

3.6. Kết quả dựng cây phát sinh loài ..................................................................50

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận..........................................................................................................60

4.2. Đề nghị ...........................................................................................................60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62