Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài và cấu trúc bậc hai Gene mrLSU (Nuclear Ribosomal Large Subunit)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI

VÀ CẤU TRÚC BẬC HAI

GENE nrLSU (NUCLEAR RIBOSOMAL LARGE SUBUNIT)

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. LAO ĐỨC THUẬN

SVTH: TRỊNH HOÀNG LUÂN

MSSV: 1153010446

KHÓA: 2011-2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

Trang i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn khoa Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô

trƣờng Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là thầy Lao Đức Thuận và cô

Lê Huyền Ái Thúy – ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn em trong suốt quá trình thực

nghiệm và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp với tất cả tinh thần trách nhiệm và lòng

yêu nghề, đã tạo điều kiện cho em đƣợc học tập tốt, có cơ hội củng cố và phát triển

những bài học mà em đã trau dồi trong bốn năm ngồi trên ghế nhà trƣờng nhằm

trang bị cho em những kiến thức để có thể tự tin bƣớc vào đời.

Trong quá trình làm việc, thời gian tuy ngắn nhƣng đã giúp em có đƣợc những bài

học kinh nghiệm từ thực tế với sự giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô.

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp không tránh khỏi những sai sót, em

kính mong quý thầy cô cùng góp ý, chỉ dẫn thêm để đề tài đƣợc hoàn chỉnh hơn.

Cuối cùng, em xin kính chúc thầy cô trƣờng Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

lời chúc sức khỏe và luôn gặt hái đƣợc nhiều thành công trong cuộc sống.

Bình Dƣơng, tháng 05 năm 2015

SINH VIÊN

Trịnh Hoàng Luân

Trang ii

DANH MỤC VIẾT TẮT

ATP : Adenosine triphosphate

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

bp : base-pair

nu : nucleotide

DNA : deoxyribonucleotide triphosphate

RNA : ribonucleic acid

LSU : large subunit

rDNA : ribosomal DNA

rRNA : ribosomal RNA

Trang iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ...........................................................15

Bảng 2.2. Các thông số thiết lập cho chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR để khuếch

đại các vùng gene nrLSU ...........................................................................................22

Bảng 3.1. Kiểm tra cặp mồi với các thông số vật lý trên IDT...................................25

Bảng 3.2. Kết quả đo OD mẫu DL0038A và DL0038B đƣợc tách chiết theo phƣơng

pháp phenol/chlloroform có bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB .........................29

Bảng 3.3. Chiều dài trình tự hai mẫu DL0038A, DL0038B trƣớc và sau khi hiệu

chỉnh............................................................................................................................38

Bảng 3.4. Hình ảnh cấu trúc bậc hai của mẫu DL0038A, DL0038B và một số mẫu

nấm khác.....................................................................................................................44

Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả định danh hai mẫu nấm DL0038A và DL0038B ........47

Trang iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cordyceps sinensis, một loài nấm kí sinh côn trùng ...................................3

Hình 1.2. Sơ đồ vị trí các vùng domain thuộc trình tự nrLSU ...................................9

Hình 2.1. Hình thái giải phẫu mấm nấm DL0038A ..................................................18

Hình 2.2. Hình thái giải phẫu mấm nấm DL0038B...................................................19

Hình 3.1. Kiểm tra mồi bằng BLAST trên NCBI......................................................26

Hình 3.2. Vị trí mồi xuôi LR05 đƣợc sắp gióng cột với các trình tự dữ liệu............27

Hình 3.3. Vị trí mồi ngƣợc LR5 đƣợc sắp gióng cột với các trình tự dữ liệu...........27

Hình 3.4. Kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 với Cordyceps Takaomontana...................28

Hình 3.5. Hình điện di cho phản ứng PCR mẫu DL0038A, DL0038B ....................29

Hình 3.6. Hiệu chỉnh cuối mạch R mẫu DL0038A ...................................................30

Hình 3.7. Hiệu chỉnh trên mạch R mẫu DL0038A....................................................31

Hình 3.8. Hiệu chỉnh đầu mạch R mẫu DL0038A ....................................................32

Hình 3.9. Kết quả hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038A trên NCBI - BLAST ............33

Hình 3.10. Hiệu chỉnh cuối mạch R mẫu DL0038B .................................................34

Hình 3.11. Hiệu chỉnh trên mạch R mẫu DL0038B..................................................35

Hình 3.12. Hiệu chỉnh đầu mạch R mẫu DL0038B...................................................36

Hình 3.13. Kết quả hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038B trên NCBI - BLAST ..........37

Hình 3.14. Cây phả hệ phân tử gen nrLSU đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp

Maximum Likelihood với bộ cơ sở dữ liệu với bootstrap 1000 lần..........................40

Hình 3.15. Cây phả hệ phân tử gen nrLSU đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp

Neighbor-Joining với bộ cơ sở dữ liệu với bootstrap 1000 lần.................................41

Hình 3.16. Cây phả hệ phân tử gen nrLSU đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp

Maximum Parsimony với bộ cơ sở dữ liệu với bootstrap 1000 lần ..........................42

Trang v

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ..............................................................................................................1

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1. CÁC LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG...........................................................2

1.1. Đặc điểm chung và thành phần loài...................................................2

1.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ......................................................4

1.3. Tiềm năng ứng dụng ..........................................................................6

2. GENE Nuclear ribosomal large subunits (nrLSU)..................................................8

3. PHẢ HỆ PHÂN TỬ .................................................................................................9

4. CẤU TRÚC THỨ CẤP..........................................................................................11

5. PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ ......................................................................13

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. CẶP MỒI SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ...................................................15

2. DANH MỤC CÁC PHẦN MỀM SỬ DỤNG .......................................................15

3. TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU ...............................................................................17

4. VẬT LIỆU..............................................................................................................18

4.1. Dụng cụ và thiết bị...........................................................................19

4.2. Hóa chất............................................................................................20

5. QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA BỘ GENE.....................................................21

6. PHẢN ỨNG PCR...................................................................................................22

6.1. Thành phần phản ứng PCR..............................................................22

6.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .....................................................22

6.3. Điện di ..............................................................................................22

6.4. Giải trình tự ......................................................................................23