Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các Gen nrLSU và ATP6

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ

SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN

TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI CÁC GEN

nrLSU VÀ ATP6

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SHPT

GVHD: ThS. Lao Đức Thuận

CN. Vũ Tiến Luyện

SVTH: Nguyễn Thị Bích Thảo

MSSV: 1153010755

Khóa: 2011-2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015.

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành gửi tới thầy Lao Đức Thuận và anh Vũ Tiến

Luyện - người luôn tận tình, kiên nhẫn và quan tâm hướng dẫn em trong suốt

quá trình làm đề tài để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Người luôn tạo điều

kiện cho em học tập, trau dồi kiến thức và rút ra nhiều bài học trong khoảng thời

gian vừa qua.

Em xin cảm ơn các bạn cùng nhóm đề tài và tập thể trong phòng thí nghiệm sinh

học phân tử, trường Đại Học Mở TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ, tạo điều kiện

trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Trên hết, con xin cảm ơn bố mẹ và gia đình đã luôn yêu thương và giúp đỡ con.

Bình Dương, ngày 05 tháng 05 năm 2015.

Danh mục bảng biểu

Bảng 2.1. Trình tự các mồi sử dụng trong phản ứng PCR.

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR.

Bảng 3.1. Các đặc tính vật lý của mồi LR0R/LR5 và ATP6-C1A/ATP6-C2A.

Bảng 3.2. Thông tin trình tự tham chiếu dùng để xây dựng dữ liệu vùng trình tự

nrLSU và Atp6.

Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 3 mẫu nấm

ký sinh côn trùng được tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform.

Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 3 mẫu nấm

ký sinh côn trùng được tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform bổ

sung β-mercaptoethanol và CTAB.

Bảng 3.5. Hiệu chỉnh các nucleotide tại các vị trí (1) đến (10).

Bảng 3.6. Tổng hợp kết quả hiệu chỉnh trình tự các mẫu nấm ký sinh côn trùng.

Bảng 3.7. Kết quả chiều dài trình tự trước và sau hiệu chỉnh.

Bảng 3.8. Kết quả các thông số của mô hình tiến hóa tốt nhất.

Bảng 3.9. Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử và hình

thái.

Danh mục hình ảnh

Hình 1.1. Cordyceps sinensis.

Hình 1.2. Cấu trúc của rDNA.

Hình 1.3. Vị trí các mồi khuếch đại gen nrLSU.

Hình 2.1. Hình thái giải phẫu nấm mẫu DL004.

Hình 2.2. Hình thái giải phẫu nấm mẫu DL0075.

Hình 2.3. Hình thái nấm mẫu DL0077.

Hình 3.1. Vị trí mồi xuôi ATP6-C1A được sắp gióng cột với các trình tự gen

Atp6.

Hình 3.2. Vị trí mồi ngược ATP6-C2A được sắp gióng cột với các trình tự gen

Atp6.

Hình 3.3. Kết quả sắp gióng cột của mồi xuôi LR0R với trình tự gen nrLSU.

Hình 3.4. Kết quả sắp gióng cột của mồi ngược LR5 với trình tự gen nrLSU.

Hình 3.5. Kết quả Annhyb cặp mồi ATP6-C1A và ATP6-C2A trên trình tự gen

Atp6.

Hình 3.6. Kết quả Annhyb cặp mồi LR0R và LR5 trên trình tự gen nrLSU.

Hình 3.7. Kết quả kiểm tra mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A bằng BLAST trên

GenBank.

Hình 3.8. Kết quả kiểm tra mồi LR0R/LR5 bằng BLAST trên GenBank.

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 mẫu DL004, DL0075, DL0077

với cặp mồi LR0R/LR5 được tách chiết theo phương pháp Phenol:Chloroform.

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 mẫu DL004, DL0075, DL0077

với cặp mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A được tách chiết theo phương pháp

Phenol:Chloroform.

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp mồi LR0R/LR5 theo phương

pháp Phenol:Chloroform có sử dụng β - mercaptoethanol và CTAB.

Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A theo

phương pháp Phenol:Chloroform có sử dụng β - mercaptoethanol và CTAB.

Hình 3.13. Trình tự DNA của mạch xuôi và ngược chưa hiệu chỉnh của gen

Atp6 trên giao diện Chromas lite.

Hình 3.14. Mô tả sự sai khác mucleotide ở hai mạch xuôi và ngược gen Atp6.

Hình 3.15. Vị trí sai lệch của hai kết quả giải trình tự ở đầu mạch xuôi của Atp6.

Hình 3.16. Kết quả BLAST trình tự gen Atp6 mạch xuôi đã hiệu chỉnh.

Hình 3.17. Cây phả hệ phân tử gen nrLSU được xây dựng bằng phương pháp

Maximum Likelihood với bộ cơ sở dữ liệu. (Các con số hiển thị trên cây là giá

trị bootstrap của 1000 lần lặp lại lần lượt của các cây NJ/MP/ML).

Hình 3.18. Cây phả hệ phân tử gen Atp6 được xây dựng bằng phương pháp

Maximum Likelihood với bộ cơ sở dữ liệu. (Các con số hiển thị trên cây là giá

trị bootstrap của 1000 lần lặp lại lần lượt của các cây NJ/MP/ML).

Hình 3.19. Cây phả hệ phân tử gen nrLSU-Atp6 được xây dựng bằng phương

pháp Maximum Likelihood với bộ cơ sở dữ liệu. (Các con số hiển thị trên cây là

giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại, lần lượt của các cây NJ/MP/ML).

Danh mục những chữ viết tắt

ATP: Adenosine triphosphate

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

Bp: Base-pair

Nu: Nucleotide

DNA: Deoxyribonucleotide triphosphate

RNA: Ribonucleic acid

ITS: Internal transcribed spacer

SSU: Small subunit

LSU: Large subunit

MP: Maximum parsimony

ML: Maximum likelihood

NJ: Neighbor-joining

rDNA: Ribosomal DNA

CTAB: Cetyl Trimethylammonium Bromide

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................1

PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1. NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG ..................................................................3

1.1.1. Đặc điểm chung.....................................................................................3

1.1.2. Sự phân bố và thành phần loài............................................................4

1.1.3. Ứng dụng của nấm Cordyceps..............................................................4

1.2. NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI............................5

1.2.1. Đặc điểm nhận dạng và định danh......................................................5

1.2.2. Định danh phân tử................................................................................7

1.2.3. Gen MT-Atp6 (Mitochondrially encoded ATP synthase 6).................7

1.2.4. DNA ribosome và gen nrLSU (nuclear ribosomal large subunit) ....8

1.3. TÁCH CHIẾT DNA VÀ KỸ THUẬT PCR............................................11

1.3.1. Tách chiết DNA...................................................................................11

1.3.2. Kỹ thuật PCR......................................................................................12

1.3.3. Giải trình tự.........................................................................................12

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC .......................................13

1.5. PHẢ HỆ PHÂN TỬ

[11]

..............................................................................15

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................20

2.1.1. Phần mềm trong khảo sát in silico ....................................................20

2.1.2. Vật liệu sử dụng trong thực nghiệm..................................................20

2.2. TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM...................................................................23

2.2.1. Khai thác và thu thập tài liệu ............................................................24

2.2.2. Khảo sát in silico .................................................................................24

2.2.3. Thực nghiệm........................................................................................25

2.2.4. Giải trình tự.........................................................................................28

2.2.5. Hiệu chỉnh trình tự .............................................................................28

2.2.6. Xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA6.0................28

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỒI....................................................................30

3.2. CƠ SỞ DỮ LIỆU CỤC BỘ TRÌNH TỰ nrLSU VÀ ATP6 NHÓM

NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG...........................................................................38

3.3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM....................................................................44

3.4. KẾT QUẢ HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ....................................................47

3.5. KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH LOÀI................................52

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................60

4.2. ĐỀ NGHỊ....................................................................................................60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................61

PHỤ LỤC

Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm Cordyceps là nấm ký sinh trên côn trùng được biết đến và sử dụng phổ

biến trong các bài thuốc cổ truyền của Trung Quốc kể cả các nước Châu Á. Đại

diện tiêu biểu của chi này là Cordyceps sinensis, chứa các chất có hoạt tính cao

ứng dụng trong y dược như kháng khối u, đáp ứng miễn dịch, chống oxi hóa,

chống tăng đường huyết, hiệu quả bảo vệ thận, nâng cao hoạt động tình dục và

sinh sản,… Chi nấm Cordyceps có hơn 400 loài đã được phát hiện. Trong đó,

chúng được định danh chủ yếu bằng phương pháp truyền thống thông qua định

danh hình thái gồm các đặc tính: quả thể, sinh bào tử, hình thái sinh sản….

Tuy nhiên, việc định danh hình thái chi Cordyceps cũng còn gặp nhiều khó

khăn và hạn chế trong việc phân loại, vì chi Cordyceps có thành phần loài rất

phong phú. Đặc biệt, nhóm này tồn tại ở hình thức sinh sản vô tính và hữu tính.

Ngoài ra, kiểu hình chi Cordyceps bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường khác

nhau tạo nên dị hình thái dễ nhầm lẫn cho các nhà nấm học khi phân loại. Trong

những năm gần đây, các tiến bộ của sinh học phân tử và ứng dụng tin sinh học,

đã đóng góp rất nhiều cho việc giải quyết những khó khăn trên. Chẳng hạn như

việc sử dụng các gen thuộc nhóm gen giữ nhà (house-keeping gen) để xây dựng

cây phát sinh loài đã mang lại hiệu quả (Sung et al., 2007).

Trong đó, gen nrLSU-rRNA mã hóa RNA 25S-28S của ribosome (tiểu phần lớn

của ribosome) có nhiều vùng bảo tồn và đa dạng. Ngoài ra, nrLSU-rRNA còn

bao gồm những vùng domain D1, D2, D3, gọi là vùng biến động (D-divergence

region) chứa nhiều thông tin duy truyền, có độ bảo tồn cao và có thể khuếch đại

bằng cặp mồi phổ quát do đó nó thích hợp cho nghiên cứu cấp độ loài thậm chí

còn vượt qua cả mức độ loài. Hơn nữa, nrLSU-rRNA được coi như là một chỉ

thị phân tử (marker) để phân loại và xác định tên loài trong một phạm vi rộng.

Cùng với gen Atp6 mã hóa cho enzym ATPase trong ty thể tiểu phần số 6 của

phức hợp F1-F0 ATPase. Mà ATPase là enzyme có vai trò quan trọng tham gia

vào quá trình tạo ATP từ ADP trong ty thể, với sự hiện diện của kênh gradient