Xây dựng quy trình NESTED - ETHYLATION SPECCIFIC PCR (NESTED MSP) và ứng dụng chúng trong khảo sát mức độ methyl hóa tại các đảo CPG thuộc vùng PROMOTER của gen p16INK4α / Tôn Nữ Tùng Kim

B() GIAO DlJC VA oAo T �o

TRlJONG D�I HQC MO TP. H6 CHI MINH

uAo cAo TONG KET

DE TAI KHOA HQC VA CONG NGHt CAP TRUONG

XAY D\JNG QUY TRINH NESTED-METHY1*T�_ON

SPECIFIC PCR (NESTED-MSP) VA UNG DVNG CHUNG

TRONG KHAO SAT MUC BO METHYL HOATAI cAc

. . . . .

BAO CpG THUQC ViJNG PROMOTER GEN pl61NK4a

Ma s6: 12-()Al. .oG,. � '3("°'

Chu nhiem ct� tai:CN. TON NU TUNG KIM .

TP. HCM, Thang 07/ 2014

-i￾MỤC LỤC

Trang

Danh mục hình ảnh & bảng biểu iii

Danh mục các chữ viết tắt v

Thông tin kết quả nghiên cứu bằng tiếng Việt vii

Thông tin kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh x

TỔNG QUAN 1

I.1. TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS 1

I.2. TỔNG QUAN VỀ GEN p16INK4a 3

I.2.1. Cấu trúc và chức năng 3

I.2.2. Sự methyl hóa của p16INK4a trong ung thư 4

I.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA DNA 5

I.3.1. Phương pháp Methylation specific PCR (MSP) 6

I.3.2. Phương pháp Nested Methylation Specific PCR (Nested-MSP) 6

I.4. TÍNH CẤP THIẾT 7

I.5. MỤC TIÊU 8

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 9

II.1. VẬT LIỆU 9

II.2. PHƯƠNG PHÁP 9

II.2.1. Phương pháp in silico 9

II.2.1.1. Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen và đảo CpG 9

II.2.1.2. Đánh giá – thiết kế mồi 9

II.2.2. Thực nghiệm 9

II.2.2.1. Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi trong phản ứng Q-MSP 9

II.2.2.2. Tách chiết DNA 11

II.2.2.3. Phương pháp biến đổi bisulfite DNA sử dụng Epitect bisulfite kit 12

II.2.2.4. Phương pháp MSP trên mẫu bệnh phẩm 14

II.2.2.5. Phương pháp Nested-MSP trên mẫu bệnh phẩm 15

II.2.2.6. Giải trình tự sản phẩm MSP 15

-ii￾II.2.2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose 15

KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN 17

III.1. Kết quả khảo sát in silico gen p16INK4α

, thiết kế các bộ mồi cho phản

ứng MSP, Nested-MSP 17

III.2. Kết quả thực nghiệm 20

III.2.1. Thử nghiệm các mồi bằng DNA chứng 20

III.2.2. Khảo sát nhiệt độ lai thích hợp cho các mồi 21

III.2.3. Một số thử nghiệm Nested-MSP và MSP trên bệnh phẩm 22

III.2.4. So sánh tính chất methyl hóa bằng Nested-MSP

và MSP trên bệnh phẩm 25

III.2.5. Xác định mối tương quan giữa tính chất

methyl hóa với ung thư vú 25

III.2.6. Khảo sát mức độ liên quan (tỉ suất chênh

– Odd ratio – OR và nguy cơ tương đối – relative risk – RR) giữa tính chất

methyl hóa với ung thư vú 30

III.2.7. Giải trình tự sản phẩm MSP 31

KẾT LUẬN 32

ĐỀ NGHỊ 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHỤ LỤC 39

-iii￾DANH MỤC HÌNH ẢNH & BẢNG BIỂU

Trang

Hình 1.1: Sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí 5’ của cytosine nhờ DNMTs 1

Hình 1.2: Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16INK4a

trong ung thư vú nói chung và phân chia theo các giai đoạn bệnh 5

Hình 1.3: Xử lý sodium bisulfite và sự chuyển đổi cytosine thành uracil 6

Hình 3.1. Định vị gen p16INK4α

trên nhiễm sắc thể số 9 17

Hình 3.2. Trình tự gen p16INK4α

và sự phân bố của

một số nhân tố phiên mã 17

Hình 3.3: Sơ đồ mô tả các vị trí của các mồi MSP và Nested-MSP trên gen

p16INK4α

18

Hình 3.4: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và

điện di trên gel agarose sản phẩm QMSP từ các cặp mồi (A): SQF-SQR, (B):

MF-MR và (C): UF-UR 20

Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại sử dụng cặp mồi ngoài SQF￾SQR 21

Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm MSP nhằm khảo sát

nhiệt độ lai tối ưu của cặp mồi MF-MR 22

Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm MSP nhằm khảo sát

nhiệt độ lai tối ưu của cặp mồi UF-UR 22

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP và MSP thử nghiệm trên bệnh

phẩm lần I 23

Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP và MSP thử nghiệm trên bệnh

phẩm lần II 24

Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm từ mồi methyl của Nested-MSP và MSP

thử nghiệm trên bệnh phẩm lần III 24

Hình 3.11: (a) Vùng trình tự gen p16INK4a chưa biến đổi bisulfite; (b) Vùng trình

tự p16INK4a biến đổi bisulfite. (c) Trình tự thu được từ giải trình tự với cặp mồi

xuôi methyl MF 31

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng Q-MSP 10

Bảng 2.2: Chu kì nhiệt của phản ứng Q-MSP 10

-iv￾Bảng 2.3: Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite của EpiTect bisulfite Kit 13

Bảng 2.4: Thành phần của phản ứng MSP 14

Bảng 2.5: Chu kì nhiệt của phản ứng MSP 15

Bảng 3.1: Trình tự các mồi và các thông số vật lý 19

Bảng 3.2. Mối tương quan giữa tỷ lệ methyl hóa tại vùng promoter ở gen

p16INK4α

với ung thư vú 26

Bảng 3.3. Mối tương quan giữa tỷ lệ methyl hóa tại vùng promoter ở gen

p16INK4α

với các yếu tố lâm sàng trên bệnh nhân ung thư vú 27

Bảng 3.4. Mối tương quan giữa tỷ lệ methyl hóa tại vùng promoter ở gen

p16INK4α

với tình trạng biểu hiện Her2/neu và p53 trên bệnh nhân ung thư vú và

lành tính 29

Bảng 3.5. Mức độ liên quan giữa tính chất methyl hóa tại vùng promoter ở gen

p16INK4α

với ung thư vú 30