Xây dựng quy trình PMA real-time PCR phát hiện Listeria monocytogenes và salmonella spp trên mẫu sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

ĐỖ NGỌC DIỄM TRÚC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH

PMA REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN

Listeria monocytogenes VÀ Salmonella spp

TRÊN MẪU SỮA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Đỗ Ngọc Diễm Trúc

Ngày sinh: 15/08/1985 Nơi sinh: Sóc Trăng

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên: 1884202010008

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho

Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở

Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống

thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Xây dựng qui trình PMA Real-time

PCR phát hiện Listeria monocytogenes và Salmonella spp trên mẫu sữa” là

bài nghiên cứu của chính tôi.

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn

này, tôi cam đoan rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này

chưa từng được công bố hoặc được sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi

khác.

Không có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng

trong luận văn này mà không được trích dẫn theo đúng quy định.

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại

các trường đại học hoặc cơ sở đào tạo khác.

TP. Hồ Chí Minh, Năm 2020

ĐỖ NGỌC DIỄM TRÚC

ii

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa

Công Nghệ Sinh Học đã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản cũng như giúp tôi

định hướng đúng đắn trong quá trình học tập.

Đặc biệt, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo PGS.TS

Lê Huyền ÁI Thuý, Trưởng khoa Công Nghệ Sinh Học đã dành thời gian, trực tiếp

chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành tốt luận văn này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các anh chị nhân viên

trong Công ty Cổ phần Công Nghệ TBR đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi

trong quá trình triển khai thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

iii

TÓM TẮT

Sữa và các sản phẩm từ sữa đóng vai trò quan trọng về chế độ dinh dưỡng

hàng ngày của mọi người trên toàn thế giới. Tuy nhiên sữa giàu dưỡng chất nên dễ

nhiễm vi sinh ở tất cả các giai đoạn từ chế biến đến quá trình tiêu dùng. Hai tác

nhân phổ biến gây ngộ độc trong sữa là Salmonella spp và Listeria monocytogenes.

Trong đó Salmonella spp được ghi nhận là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ

biến thứ 2 (Aarestrup và cộng sự, 2007). Việc nhiễm Listeria là tương đối hiếm,

nhưng thường tiến triển nặng với tỉ lệ tử vong cao từ 20% - 30% (theo báo cáo của

FAO và WHO năm 2001).

Để phát hiện vi sinh gây ngộ độc thực phẩm thì phương pháp nuôi cấy

truyền thống được xem là tiêu chuẩn vàng. Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy lại tốn

kém thời gian và nhân lực, không đáp ứng được yêu cầu cần có kết quả nhanh trong

việc ứng dụng quy trình vào thực tế. Phương pháp Real-time PCR đã được phát

triển với các đặc tính như phát hiện nhanh, chuyên biệt và đơn giản hơn phương

pháp nuôi cấy truyền thống, đặc biệt cho phép phát hiện một hoặc nhiều tác nhân

đồng thời. Mặc dù vậy, kỹ thuật phân tử này có thể cho kết quả dương tính giả do

không phân biệt được vi khuẩn còn sống hay đã chết khi áp dụng vào thực tế với

bước thanh trùng sản phẩm làm chết vi sinh vật nhưng DNA vi khuẩn vẫn còn hiện

diện trong sản phẩm sau bước tiệt trùng. Để cải thiện vấn đề này, các công trình

nghiên cứu đã cho ra đời sự kết hợp giữa kỹ thuật PCR với chất nhuộm sinh học,

propidium monoazide (PMA), một dẫn xuất của ethidium bromide. Cách kết hợp

này cho phép phát hiện DNA từ các tế bào có màng nguyên vẹn dựa trên đặc tính

của thuốc nhuộm PMA. PMA có thể xâm nhập qua màng tế bào ở vi khuẩn chết,

gắn vào DNA bằng liên kết cộng hóa trị. DNA sau khi đã gắn với PMA thì không

thể khuếch đại dẫn đến ức chế phản ứng PCR (Nocker và cộng sự, 2006). Việc ứng

dụng quy trình PMA real-time PCR nhằm phát hiện Salmonella spp và Listeria

monocytogenes đã được công bố qua một số công trình trên thế giới. Tuy nhiên

trong nước chúng tôi chưa tìm thấy bất cứ công bố nào về việc sử dụng PMA kết

hợp PCR hay Real-time PCR trong phát hiện vi sinh vật nói chung và các tác nhân

iv

vi sinh gây ngộ độc sữa như Listeria monocytogenes và Salmonella spp nói riêng.

Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm bước đầu xây dựng quy trình PMA

Real-time PCR, phát hiện đồng thời Listeria monocytogenes và Salmonella spp trên

mẫu sữa nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước, hạn chế việc nhập khuẩn, có thể giảm

giá thành và chủ động hơn trong việc kiểm nghiệm.

Kết quả ghi nhận giới hạn phát hiện của quy trình PMA Real-time PCR là

10CFU/ml trên mẫu chuẩn L. monocytogenes và trên mẫu chuẩn Salmonella. Mặc

khác độ nhạy của quy trình trên mẫu gây nhiễm salmonella là 10CFU/ml và trên

mẫu gây nhiễm L.monocytogenes là 102CFU/ml. Không ghi nhận mẫu thực nghiệm

nhiễm Salmonella và L. monocytogenes

v

ABSTRACT

Milk and dairy products play an important role in the daily nutrition and

diet of people in the world. Milk is rich in nutrients so it can easily be contaminated

by microborganisms at all stages from processing to consumption. Two common

milk poisoning authors are Salmonella spp and Listeria monocytogenes. Salmonella

spp was recognized as the second most common food poisoning agent (Arilyrup et

al., 2007). Listeria is relatively rare, but often develops severely with high mortality

rates between 20% and 30% (FAO and WHO reports in 2001).

For the detection of food poisoning microbes, traditional culture methods are

considered the gold standard. However, the culture method is time-consuming and

labor-intensive, does not meet the requirement for fast results in the practical

application of the process. The Real-time PCR method has been developed with

features such as faster, more specialized and simpler than the traditional culture

method, especially allowing the detection of one or more agents simultaneously.

This molecular technique can give false positive results because it is impossible to

distinguish live or dead bacteria when applied in practice with the sterilization step

of the product that kills microorganisms but the bacterial DNA. still present in the

product after pasteurization. In order to improve this problem, studies have shown a

combination of PCR technique with a biological dye, propidium monoazide

(PMA), a derivative of ethidium bromide. This combination allows the detection of

DNA from intact membrane cells based on the properties of the PMA dye. PMA

can penetrate the cell membrane of dead bacteria, attaching to the DNA by covalent

bond. DNA after binding to PMA cannot be amplified, leading to inhibition of PCR

reactions (Nocker et al., 2006). The application of PMA real-time PCR process to

detect Salmonella spp and Listeria monocytogenes has been published in the world.

In Viet Nam, we have not found any claim on the use of PMA in combination with

PCR or Real-time PCR in the detection of microorganisms in general and milk

poisoning microorganisms such as Listeria monocytogenes and Salmonella. spp in

particular. Therefore, this study is carried out to initially build PMA Real-time PCR

vi

process, simultaneously detecting Listeria monocytogenes and Salmonella spp on

milk samples to meet domestic demand, limit bacteria entry, possibly reduce costs

and be more proactive in testing.

The results recorded detection limit of PMA Real-time PCR procedure was

10CFU /ml on the culture pure Listeria monocytogenes and on the standard

Salmonella. On the other hand, the sensitivity of the procedure on samples

contaminated with salmonella is 10CFU / ml and on samples contaminated with L.

monocytogenes is 102CFU / ml. No experimental samples were found to be

contaminated with Salmonella and L. monocytogenes