Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidla trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật PCR và Realtime PCR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

----------

PHẠM QUỲNH TRANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU

BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR

VÀ REALTIME PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

----------

PHẠM QUỲNH TRANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU

BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR

VÀ REALTIME PCR

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Văn Long

Khoa Sinh học phân tử – Bệnh viện Trung ương quân đội 108

Thái Nguyên - 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu cửa tôi dưới sự hưỡng dẫn

của TS. Nguyễn Văn long. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai

công bố trong một công trình nào khác.

Thái nguyên, tháng 11 năm 2017

Tác giả

Phạm Quỳnh Trang

ii

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu

sắc tới TS. Nguyễn Văn Long đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong

suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Bs. Phan Quốc Hoàn đã tạo điều kiện để

tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân

đội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân

đội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học,

Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận

lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ,

giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017

Học viên

Phạm Quỳnh Trang

iii

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................vi

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii

DANH MỤC VIẾT TẮT................................................................................................ix

MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1

1. Đặt vấn đề....................................................................................................................1

2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................2

CHƯƠNG I......................................................................................................................3

TỔNG QUAN..................................................................................................................3

1. Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc ...............................................................................3

1.1. Giác mạc ...........................................................................................................4

1.1.1. Biểu mô ....................................................................................................4

1.1.2. Màng đáy và màng Bowmann...................................................................5

1.1.3. Nhu mô ......................................................................................................5

1.1.4. Màng Descemet.........................................................................................5

1.1.5. Nội mô .......................................................................................................5

1.2. Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc ...........................................................6

1.3. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc ...........................6

1.3.1. Triệu chứng cơ năng..................................................................................6

1.3.2. Triệu chứng thực thể..................................................................................7

2. Microsporidia .........................................................................................................8

2.1. Giới thiệu chung ...............................................................................................8

2.2. Bệnh học và nguy cơ ......................................................................................11

2.3. Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia ...............................................12

2.4. Chẩn đoán viêm loét giác mạc........................................................................12

2.5. Các phương pháp phát hiện Microsporidia....................................................13

2.5.1. Chẩn đoán phân biệt ...................................................................................13

2.5.2. Chẩn đoán xác định .................................................................................14

iv

3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong điều trị Microsporidia gây bệnh

viêm loét giác mạc ở Việt Nam.............................................................................19

3.1. Tình hình điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam

hiện nay..................................................................................................................19

3.2. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR và Realtime

PCR để điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam. ..........20

Chương II.......................................................................................................................22

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP........................................................................................22

1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................22

2. Hóa chất, thiết bị....................................................................................................22

2.1. Hóa chất..........................................................................................................22

2.2. Thiết bị, máy móc...........................................................................................23

2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................24

2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số.....................................................24

2.3.2. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ

...........................................................................................................................25

2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................................25

2.3.4. Phương pháp xác định trình tự axit nucleic.............................................26

2.3.5. Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng phương pháp PCR và

Realtime PCR ....................................................................................................28

2.3.5.1. Xác định độ nhạy của phương pháp PCR và Realtime PCR................30

CHƯƠNG III.................................................................................................................36

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................................36

3.1. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR và

Realtime PCR ........................................................................................................36

3.2. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR ..................39

3.2.1. Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR và Realtime PCR...........................39

3.2.2. Đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR.....................41

3.3. Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia .........................................43

3.4. Thử nghiệm kỹ thuật PCR và Realtime PCR phát hiện Microsporidia trên các

mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt ................................................................46