Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và hình thành biofilm của bacillus subtilis được phân lập trong hợp chất polyme ngoại bào

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐINH HÀ THƯƠNG

NGHIÊN CỨU YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN

SỰ PHÁT TRIỂN VÀ HÌNH THÀNH BIOFILM CỦA

BACILLUS SUBTILIS ĐƯỢC PHÂN LẬP TRONG HỢP

CHẤT POLYME NGOẠI BÀO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Đà Nẵng – Năm 2021

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐINH HÀ THƯƠNG

NGHIÊN CỨU YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN

SỰ PHÁT TRIỂN VÀ HÌNH THÀNH BIOFILM CỦA

BACILLUS SUBTILIS ĐƯỢC PHÂN LẬP TRONG HỢP

CHẤT POLYME NGOẠI BÀO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ ĐÔNG PHƯƠNG

Đà Nẵng – Năm 2021

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này, lời đầu tiên

tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến người cô trực tiếp chỉ bảo và

hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn -

TS. Nguyễn Thị Đông Phương. Ngoài ra tôi xin chân thành cảm ơn các

Thầy, Cô trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã giảng dạy cho

tôi nhiều kiến thức cũng như kinh nghiệm nghiên cứu quý báu..

Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới các Thầy, Cô bộ môn Công

nghệ Sinh học trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật – Đại học Đà Nẵng đã

tạo điều kiện và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động

viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành quá trình học tập và

nghiên cứu.

Đà Nẵng, tháng 3 năm 2021

Học viên

Đinh Hà Thương

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu được chính tôi thực hiện dưới

sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Đông Phương.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai

công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Đà Nẵng, tháng 3 năm 2021

Học viên

Đinh Hà Thương

NGHIÊN CỨU YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ

HÌNH THÀNH BIOFILM CỦA BACILLUS SUBTILIS ĐƯỢC

PHÂN LẬP TRONG HỢP CHẤT POLYME NGOẠI BÀO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Họ và tên học viên: Đinh Hà Thương

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Đông Phương

Cơ sở đào tạo: Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng.

Tóm tắt:

Bacillus subtilis (B. subtilis) là vi khuẩn có lợi được ứng dụng rất nhiều vào các lĩnh vực

môi trường như chế phẩm vi sinh xử lý nước thải, vào dược phẩm như sản phẩm trị tiêu chảy, vào

cây trồng như một chất cố định đạm hay ức chế các vi khuẩn làm thúi gốc, rễ của cây trồng, vào

phân bón…mà những môi trường này sở hữu những yếu tố khắc nghiệt như độ pH, độ

mặn…Những nghiên cứu trong luận văn được thực hiện để cung cấp thêm thông tin khoa học về

các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập trong

hợp chất polyme ngoại bào. Kết quả nghiên cứu cho thấy: B. subtilis mới được phân lập có khả

năng sinh biofilm của trong cả môi trường lỏng và rắn. Từ đó, khảo sát được B. subtilis MT300402

có khả năng sản xuất màng sinh học ở môi trường có pH trong khoảng pH từ 6,5 – 8,0 và có thể

sống sót trong điều kiện muối lên đến 4% (w/v). Trong thời gian tới, đề nghị tiếp tục nghiên cứu,

xác định gen mã hóa hình thành biofilm cũng như xác định thành phần môi trường dinh dưỡng lý

tưởng cho việc hình thành biofilm của các chủng B. subtilis phân lập được từ nước thải thủy hải

sản. Từ đó ứng dụng vào sản xuất thực tế.

Từ khóa: màng sinh học, Bacillus subtilis, hợp chất polime ngoại bào, nồng độ muối,

độ pH.

Xác nhận của giáo viên hướng dẫn Người thực hiện đề tài

Đinh Hà Thương

INVESTIGATION OF EFFECTS ON THE GROWTH AND

BIOFILM PRODUCTION OF BACILLUS SUBTILIS ISOLATED

FROM EXTRACELLULAR POLIMERIC SUBSTANCE

Major: Experimental biology

Full name of Master student: Đinh Ha Thuong

Supervisor: Nguyen Thi Dong Phuong, Ph.D.

Training Insitution: The University of Da Nang – University of

Education

Abstract:

Bacillus subtilis (B. subtilis) is a non-pathogenic bacteria that is widely used in environmental

applications such as microbial preparations for wastewater treatment, in pharmaceuticals such as

anti-diarrheal products, in plants as a nitrogen fixer or as an inhibitor of inhibiting bacteria that

cause root rot, and fertilizers, etc., which have harsh factors such as pH, salinity, nutrient

ingredients etc. The studies in the thesis were carried out to provide more scientific information

such as factors affecting growth and biofilm formation of B. subtilis isolated in extracellular

polymeric substances. Research results pointed out that isolated B. subtilis with accession number

MT300402 is capable of producing biofilm in both liquid and solid media. In addition, it was

investigated that B. subtilis MT300402 has the ability to produce biofilm in an environment with

pH in the range of 6.5 - 9.0 and can survive in salt conditions up to 4% (w/v). In the coming time, it

is proposed to continue to research, identify genes encoding biofilm formation as well as determine

the ideal nutrient medium composition for biofilm formation of B. subtilis strains isolated from

aquatic wastewater, seafood. From there apply to actual production.

Key word: biofilm, Bacillus subtilis, extracellular polymeric substance (EPS), salt

concentration, pH concentration.

Supervior’s confirmation Student

Đinh Hà Thương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..................................................................................................1

1. Tính cấp thiết của đề tài...............................................................................1

2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................3

2.1. Mục tiêu tổng quát.................................................................................3

2.2. Mục tiêu cụ thể ......................................................................................3

3. Ý nghĩa của đề tài .........................................................................................3

3.1. Ý nghĩa khoa học ...................................................................................3

3.2. Ý nghĩa thực tiễn....................................................................................4

4. Bố cục đề tài .................................................................................................4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................5

1.1. Tổng quan về Bacillus subtilis................................................................5

1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại.........................................................5

1.1.2 Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên..........................5

1.1.3 Đặc điểm hình thái...........................................................................6

1.1.4 Ứng dụng..........................................................................................6

1.2 Tổng quan về biofilm..............................................................................8

1.2.1 Quá trình hình thành màng sinh học ...............................................8

1.2.2 Thành phần của màng sinh học .....................................................11

1.2.3 Ứng dụng của biofilm.....................................................................14

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm.................................17

1.3.1 Nhiệt độ ..........................................................................................17

1.3.2 Độ pH.............................................................................................18

1.3.3 Độ muối..........................................................................................19

1.3.4 Tính chất bề mặt giá thể.................................................................19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU ................................................................................................21

2.1 Đối tượng ..............................................................................................21

2.2 Nội dung nghiên cứu.............................................................................21

2.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu .............................................22

2.3.1 Hóa chất.........................................................................................22

2.3.2 Dụng cụ, thiết bị.............................................................................22

2.4 Phương pháp pháp nghiên cứu .............................................................22

2.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu biofloc vi tảo được nuôi

trong nước thải thủy hải sản. ............................................................................22

2.4.2 Xác định tính chất sinh hóa của B. subtilis nghi ngờ ....................25

2.4.3 Định danh.......................................................................................27

2.4.4 Đánh giá khả năng đối kháng của B. subtilis với E.Coli...............28

2.4.5 Xác định khả năng hình thành biofilm...........................................32

2.4.6 Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ muối và pH đến sự phát triển

và hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập. .......................................33

2.5 Phân tích hình ảnh cộng đồng vi khuẩn trong biofilm bằng kính hiển vi

điện tử quét (SEM)................................................................................................34

CHƯƠNG 3 ................................................................................................36

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..........................................................................36

3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ mẫu biofloc vi tảo được nuôi trong nước

thải thủy hải sản..............................................................................................36

3.1.1 Phân lập vi khuẩn...........................................................................36

3.1.2 Đánh giá khả năng đối kháng của B. subtilis với E. Coli...............40

3.2. Xác định đặc tính sinh biofilm của B. subtilis phân lập..........................43

3.2.1 Đường thẳng liên hệ giữa sự sinh trưởng của B. subtilis phân lập

(KL12) và mật độ quang .......................................................................................43

3.2.2 Thử nghiệm đặc tính sinh biofilm của KL12 ...................................43

3.2.3 Phân tích quần thể vi khuẩn trong lớp màng sinh học dưới kính hiển

vi điện tử quét (SEM) ........................................................................................46

3.3 Xác định sự ảnh hưởng của ph và nồng độ muối đến sự phát triển và

hình thành biofilm của B. subtilis được phân lập..................................................48

3.3.1 Xác định sự ảnh hưởng của pH đến sự phát triển và hình thành

biofilm của B. subtilis được phân lập ...............................................................49

3.3.2 Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự phát triển và hình

thành biofilm của B. subtilis được phân lập .....................................................52

KẾT LUẬN ................................................................................................56

KIẾN NGHỊ....................................................................................................57

PHỤ LỤC ................................................................................................72

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi...........6

Hình 1.2 Cơ chế hình thành biofilm của vi sinh vật phù du ............................9

Hình 2.1 Kỹ thuật phân lập ............................................................................24

Hình 2.2 Kháng khuẩn dựa theo phương pháp khuếch tán............................29

Hình 2.3 Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật..........................................30

Hình 2.4 Sơ đồ pha loãng mẫu.......................................................................31

Hình 2.5 Ống nghiệm nuôi cấy qua đêm trên máy lắc ................................333

Hình 2.6 Phương pháp xác định vi khuẩn trong biofilm bằng cách pha

loãng trãi lên môi trường LBA, xác định mật độ vi khuẩn CFU/ml....................34

Hình 3.1 Các khuẩn lạc mọc lên bề mặt môi trường LBA ............................36

Hình 3.2 Taxanomy của các chủng được định danh......................................38

Hình 3.3 Khả năng kháng khuẩn của B. subtilis phân lập đối kháng E. coli

ATCC25922. ........................................................................................................40

Hình 3.4 So sánh tính đối kháng của vi khuẩn B. subtilis phân lập từ EPS

và B. subtilis có nguồn gốc phân lập từ đất .........................................................42

Hình 3.5 . Mối quan hệ giữa sự sinh trưởng của KL12 và mật độ quang ở

bước sóng 600nm. ................................................................................................43

Hình 3.6 a. Biofilm được tạo thành trên bề mặt môi trường rắn LBA của

KL12; b. Biofilm được tạo thành trên bề mặt môi trường lỏng LB của KL12....44

Hình 3.7 Cấu trúc màng sinh học được quan sát bằng kính hiển vi điện tử

quét SEM..............................................................................................................47

Hình 3.8 Mật độ vi khuẩn B. subtilis trong lớp màng sinh học .....................49

Hình 3.9 Sự thay đổi của nồng độ muối ảnh hưởng đến việc sản xuất

màng sinh học của chủng B. subtilis MT300402.................................................52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Đặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn B. subtilis................ 37

Bảng 3.2 Kết quả giải trình tự được kí gửi dữ liệu ở ngân hàng Genome.39

Bảng 3.3 Sự hình thành màng sinh học theo sự thay đổi pH môi trường

dinh dưỡng ...................................................................................................... 50

Bảng 3.4 Sự ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sản xuất màng sinh học

của KL12 trên môi trường rắn LBA................................................................ 54