Khảo sát thành phần hoá học, hoạt tính enzyme, khả năng tiêu hoá cùa ba (3) loại hạt nguyên liệu: kê trắng, kê vàng, kê đỏ :Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu Khoa học cấp Trường

BỘ CÔNG THƯƠNG

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: Khảo sát thành phần hoá học, hoạt tính enzyme, khả năng tiêu hoá cùa

ba (3) loại hạt nguyên liệu: kê trắng, kê vàng, kê đỏ

Mã số đề tài: 21/1SHTPSV05

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Hữu Hiếu

Đơn vị thực hiện: Viện công nghệ Sinh học và Thực Phẩm

1

LỜI CÁM ƠN

Cảm ơn Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ kinh phí

cho đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên mã số 21/1SHTPSV05, đồng cảm ơn Viện

Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về trang thiết bị để

chúng tôi hoàn thành nghiên cứu này.

Chúng em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hà Diệu Trang đã tận tình giúp đỡ,

định hướng cách tư duy và cách làm việc khoa học. Đó là những góp ý hết sức quý

báu không chỉ trong quá trình thực hiện nghiên cứu này mà còn là hành trang tiếp

bước cho em trong quá trình học tập và lập nghiệp sau này.

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

2

PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG

I. Thông tin tổng quát

1.1. Tên đề tài: Khảo sát thành phần hoá học, hoạt tính enzyme, khả năng tiêu hoá

cùa ba (3) loại hạt nguyên liệu: kê trắng, kê vàng, kê đỏ

1.2. Mã số:21/1SHTPSV05

1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT

Họ và tên

(học hàm, học vị) Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

1 Nguyễn Hữu Hiếu

(sinh viên)

Viện công nghệ Sinh

Học và Thực Phẩm

Chủ nhiệm đề tài

1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

1.5. Thời gian thực hiện:

1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 3 năm 2021 đến tháng 3 năm 2022

1.5.2. Gia hạn (nếu có): đến tháng….. năm…..

1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng….. năm…… đến tháng….. năm…..

1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Không

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện;

Nguyên nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)

1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 10.000.000 VND (mười triệu

đồng)

II.Kết quả nghiên cứu

1. Đặt vấn đề

Hạt kê được coi là một trong những loại ít dị ứng nhất, trong hầu hết các loại ngũ cốc

có thể tiêu hóa được và là loại ngũ cốc làm ấm vì vậy nó giúp làm nóng cơ thể vào

mùa lạnh hoặc mưa. Tuy nhiên, việc sử dụng hạt kê bị hạn chế do bản chất của hạt.

Nó có hàm lượng chất xơ cao và bên ngoài lớp vỏ của hạt dày, chế biến khó, cho chất

lượng cảm quan kém và quan trọng nhất là khó tiêu hóa nên con người không lựa

chọn hạt kê là thực phẩm trong bữa ăn mà thường được sư dụng làm thức ăn cho chim.

Ngoài ra, thiếu nguồn đầu ra và phát triển sản phẩm dẫn đến hạt kê chưa được đánh

giá đúng giá trị kinh tế của nó cả về sản xuất và tiêu dùng [1]. Ngoài ra, ở khu vực

miền tây nước ta vừa qua đã xảy ra tình trạng hạn hán, không có nguồn nước để tưới

3

tiêu dẫn đến mất mùa thiệt hại rất lớn cho người dân. Hạt kê là một loại nông sản này

được ưa thích nhờ có năng suất cao và vụ mùa ngắn thích hợp trồng ở điều kiện khô

cằn, nhiệt độ cao. Một trong những vấn đề của an ninh lương thực trên thế giới là giải

quyết vấn đề về lương thực cho dân số tăng lên 9 tỷ người vào năm 2050 và cung cấp

nguồn lương thực giàu dinh dưỡng cho những địa phương thường xuyên xảy ra thiên

tai. Do tác động của biến đổi khí hậu và nước biển dâng, nông nghiệp Việt Nam có

nguy cơ giảm 7,2 triệu tấn lúa và ảnh hưởng đến 32,2% diện tích đất nông nghiệp vào

cuối thế kỷ 21 [2]. Do đó, hiện trạng này đặt ra nhu cầu cần phải sản xuất ra được

nhiều lương thực hơn trên cơ sở tài nguyên thiên nhiên ngày càng cạn kiệt để đảm

bảo khả năng tiếp cận lương 2 thực công bằng hơn cho mọi người dân. Vì cây kê là

loại cây trồng chịu hạn tốt, mang lại năng suất cao và cây trồng tiềm năng cho biến

đối khí hậu. Ở Việt Nam, hạt kê là nguồn nguyên liệu chứa rất nhiều chất dinh dưỡng,

không có gluten, cây trồng dễ, năng suất cao và chịu hạn tốt [1]. Tuy nhiên, hạt kê

chưa được nhiều người biết đến và sử dụng rộng rãi. Ngoài ra, về bản chất thành phần

của hạt theo nhiều nghiên cứu, hạt kê là loại hạt có chứa thành phần khó tiêu hóa

2. Mục tiêu

2.1. Mục tiêu tổng quát

Mục tiêu của đề tài là khảo sát và rút ra được các thông số ban đầu về thành phần hóa

học, hoạt tính enzyme, và khả năng tiêu hóa của ba loại hạt kê: kê proso trắng, kê

đuôi chồn vàng và kê ngón tay đỏ trồng tại Việt Nam, Mỹ và Châu Á. Kết quả của đề

tài nghiên cứu này thu nhận được nhờ vào thực nghiệm trên hạt kê nguyên liệu có thể

phục vụ cho sự so sánh về sự thay đổi của hạt kê trước khi hạt được nảy mầm và đồng

thời cung cấp thông tin hữu ích cho ngành công nghiệp thực phẩm khi xây dựng các

sản phẩm từ hạt kê, nhằm mục địch tăng tiềm năng và giá trị sử dụng của nguồn lương

thực cao lương này.

2.2. Mục tiêu cụ thể.

- Xác định thành phần hóa học đa lượng và vi lượng của ba loại hạt kê

- Xác định hoạt tính enzyme của ba loại hạt kê

4

- Xác định khả năng tiêu hóa protein của ba loại hạt kê

- Xác định biến sự đặc trưng và mối liên hệ giữa các chỉ tiêu chất lượng (mục tiêu

1,2,3) và ba loại hạt kê

- Xác định sự phân bố nhóm khi so sánh tổng quát ba loại hạt kê

3. Phương pháp nghiên cứu

3.1. Phương pháp hóa lý

3.1.1. Xác định độ ẩm: theo TCVN 9934:2013 [23]

3.1.1.1. Quy trình

Đối với sản phẩm đã được nghiền thì cân nhanh tất cả phần nghiền thu được cho vào

cốc đã được làm khô và cân trước, cùng với nắp, chính xác đến 0,2 mg, cân khoảng

1g mẫu ghi lại khối lượng. Đặt cốc chứa mẫu vào tủ sấy, nhiệt độ 105 ̊C với thời gian

sấy 2 giờ.

Sau 2 giờ, lấy cốc để vào bình hút ẩm trong 3 phút để cốc giảm nhiệt lượng, cân cốc

chính xác đến 0,2 mg. Lặp lại các thao tác quy định ở trên cho đến khi thu được khối

lượng không đổi (nghĩa là cho đến khi chênh lệch giữa hai lần cân liên tiếp nhỏ hơn

0,6 mg).

3.1.1.2. Công thức tính toán

Trong đó:

m0 là khối lượng của đĩa rỗng và nắp đã được sấy, tính bằng gam (g).

m1 là khối lượng của đĩa cùng với phần mẫu thử và nắp trước khi sấy, tính bằng gam

(g).

m2 là khối lượng của đĩa cùng với phần mẫu thử và nắp sau khi sấy, tính bằng gam

(g).

5

3.1.2. Xác định hàm lượng tro: bằng phương pháp nung theo TCVN

8124:2009 và ISO 712 [24]

3.1.2.1. Quy trình

Cân khoảng 10 - 20g mẫu trong cốc nung. Đốt trên bếp điện để than hoá. Nung ở

nhiệt độ 500 ̊C cho đến khi thu được tro màu trắng ngà (khi có mặt sắt sẽ có màu đỏ

gạch, có mặt đồng và mangan có màu xanh nhạt).

Làm nguội trong bình hút ẩm. Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có

khối lượng không đổi. Để tăng nhanh quá trình tro hoá có thể cho vào cốc chứa tro

(đã nguội) 3 - 5 giọt hydroperoxit 5%, sau đó tiến hành như trên

3.1.2.2. Công thức tính toán

Trong đó:

m - lượng mẫu cân (g).

m1 - khối lượng cốc nung (g).

m2 - khối lượng cốc nung và tro (g).

3.1.3. Xác định hàm lượng protein: theo TCVN 10385:2014 [25].

3.1.3.1. Quy trình

Vô cơ hoá mẫu bột hạt kê thành dạng lỏng. Dùng pipet lấy 10 ml mẫu thử (Vs) cho

vào bình Kjeldahl và chuyển vào bình vài viên trợ sôi. Làm nóng nhẹ bằng cách để

trong hoặc trên thiết bị thủy phân cho đến khi mẫu thử có màu đen nhưng không làm

bay hơi đến khô hoàn toàn. Để nguội.

Dùng 4 ml axit suifuric đậm đặc cho một gam chất rắn hòa tan mà chủ yếu là đường

để tính hàm lượng chất rắn hòa tan của mẫu thử từ tỷ trọng tương đối xác định được

trong TCVN 8907 (EN 1131).

Sau khi nguội, chuyển vào bình Kjeldahl lượng axit sulfuric đậm đặc tính được cộng

với 1 ml dư. Thêm 0,9 g hỗn hợp chất xúc tác và hạt selen dioxit.

Làm nóng nhẹ lại trên hoặc trong thiết bị thủy phân, sau đó đun sôi cho đến khi dung

dịch trong và thường xuyên lắc bình cho đến khi không có hạt nguyên liệu nào dính

trên cổ bình. Sau đó, giữ chất lỏng sôi tiếp trong 60 phút. Để nguội đến nhiệt độ

phòng. Thêm cẩn thận khoảng 35 ml nước. Trộn và để nguội lại.

6

Chưng cất

Chuyển vào bình nón 30 ml dung dịch axit boric và một hoặc hai giọt dung dịch chất

chỉ thị. Trộn. Đặt bình nón dưới bình ngưng sao cho đầu ra của ống ngập trong dung

dịch axit boric. Chuyển lượng chứa trong bình Kjeldahl vào thiết bị chưng cất. Dùng

ống đong bổ sung 20 ml dung dịch natri hydroxit.

Chưng cất để thu được khoảng 100 ml dịch chưng cất trong khoảng 4 phút đến 5 phút.

Đảm bảo rằng dịch chưng cất được làm nguội hiệu quả và nhiệt độ của lượng chứa

trong bình nón không vượt quá 25 °C trong suốt quá trình chưng cất. Khoảng 30s

trước khi kết thúc quá trình chưng cất, hạ thấp bình nón sao cho đầu ra của ống không

bị nhúng sâu trong dung dịch axit và tráng đầu ống bằng một lượng nhỏ nước.

Chuẩn độ: Chuẩn độ dịch chưng cất trong bình nón, sử dụng dung dịch chuẩn cho

đến khi chất chỉ thị đổi sang màu hồng. Ghi lại thể tích (V) của axit sulfuric hoặc axit

clohydric tiêu tốn.

3.1.3.2. Công thức tính toán

Trong đó:

Biểu thị hàm lượng nitơ, rN của mẫu thử đến số nguyên. Đơn vị (mg/l), đổi sang (%)=

(mg/l) /10.000

V là thể tích, dung dịch axit sulfuric hoặc dung dịch axit clohydric cần cho phép xác

định, tính bằng mililit (ml);

Vs là thể tích của phần thử, tính bằng mililit (ml).

Cần tính đến hệ số pha loãng và mối liên hệ với khối lượng hoặc thể tích. Nếu mẫu

cô đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) thì ghi lại tỷ trọng

tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó.

7

3.1.4. Xác định hàm lượng lipid: Phương pháp hydrolysis – extraction (AOAC

996.06, Vu et al 2019) [26]

3.1.4.1. Quy trình

Cân 1 g mẫu rắn xử lý với 6 ml of 5M HCl trong ống nghiệm có nắp. Vortex mạnh

hỗn hợp 10s, và gia nhiệt trong bể nước nóng (80 ̊C/60 phút). Lắc ống nghiệm, 10

phút lắc một lần.

Sau khi thủy phân, làm nguội ống nghiệm bằng nước. Thêm 7 ml ethyl ether vào ống

nghiệm. Lắc ống nghiệm trong 10 phút. Ly tâm (5000-6000 rpm, 5-10 phút), thu dung

môi trên sang một erlen sạch (cân erlen trước khi chuyển dung môi sang). Thêm 7 ml

ethyl ether, và lập lại quá trình trích ly thêm hai lần. Làm bay hơi dung môi bằng khí

N2. Cân lại erlen.

3.1.4.2. Công thức tính toán

Trong đó:

m - lượng mẫu cân (g).

m1 - khối lượng erlen (g).

m2 - khối lượng cốc nung và lipid trong mẫu (g).

3.1.5. Xác định cacbonhydrate: [27]

Hàm lượng cacbonhydrate (%)=100 - ( Hàm lượng % Protein + Hàm lượng % Lipid

+ Hàm lượng % Tro + Hàm lượng % Độ ẩm)

3.1.6. Xác định hàm lượng phenolic acids: [39]

3.1.6.1. Quy trình.

Free PAs

Cân 1g bột hạt, ghi chú số lượng, số cân 4 số lẻ. Loại béo bằng cách : hút 5mL Diethyl

ether vào mẫu, vortex lắc 1 phút, ly tâm 5000 rpm trong 10 phút, tách bỏ dịch trên,

thu cặn dưới. Để cặn dưới bay hơi hết dung môi, xốc mẫu lên nếu cần để dung môi

bay hết trong mẫu.

Thêm 5mL 80% MetOH, vortex, xịt khí Nitơ vào trong ống, sau đó lắc trong máy lắc

ở nhiệt độ 250C trong vòng 24h (qua đêm). Ly tâm tách dịch trên ở 5000 rmp trong

vòng 10 phút. Chỉnh pH dịch chiết xuống <2 bằng HCl đậm đặc

8

Lọc qua SPE Columns 500mg C18(EC) 3ml, gồm 4 bước:

Condition: 5 mL MeOH 100%, 3 mL DI water

Load: load hết tất cả lên cột, lặp lại 3 lần

Wash: 3 mL DI water

Elute: 2 mL MeOH 80% thu 1 mẫu

Thổi bay hơi dung môi bằng khí Nitơ, sau đó hòa tan lại bằng 200 uL MeOH 100%,

đánh siêu âm lạnh 10 phút, hút bỏ vào vial 2mL kèm insert

Bound PAs:

Cặn sau khi ly tâm, bỏ 10 mL NaOH 2M, đánh siêu âm 400C trong 90 phút. Sau đó

xịt khí nitơ vào ống, cuốn bằng giấy bạc và để trong tối qua đêm. Chỉnh pH dịch chiết

bằng HCl đậm đặc cho pH<2.

Ly tâm tốc độ 5000 rpm trong 10 phút. Thu dịch trên.

Từ dịch trên, trích ly ba lần với ethyl acetate, mỗi lần 3-5 mL

Thu tổng dịch trên ly tâm, thổi khí nitơ để bay hơi dung môi. Hòa tan các chất bằng

1 ml MeOH 100%, đánh siêu âm lạnh trong 10 phút, hút hết các mẫu lọc qua filter

0,45 µm vào trong vial.

Chạy HPLC bằng máy SHIMADZU LC-2030C 3D với pha A là dung dịch nước axit

formic 1%, pha C là methanol nguyên chất (HPLC grade), tốc độ dòng 0,8ml/phút,

thời gian chạy mỗi mẫu là 48 phút.Cột sử dụng là cột VertiSep GES C18 HPLC

4.6*250mm, 5µm. Bước sóng đo 275nm và 295nm.

Chạy std mix (5 nồng độ) xây dựng đường chuẩn vào mỗi ngày chạy mẫu. Chạy std

mix xong để vào tủ đông -20°C.

Công thức tính toán

￾à￾ ￾ượ￾￾ ￾￾￾￾ ￾ℎ￾￾￾￾￾￾ ￾￾￾￾￾ (￾￾/￾￾) = (0,2 ∗ ￾ )/(￾_￾â￾ − ￾_ẩ￾ )

￾à￾ ￾ượ￾￾ ￾￾￾￾￾ ￾ℎ￾￾￾￾￾￾ ￾￾￾￾￾ (￾￾/￾￾) = (￾ )/(￾_￾â￾ − ￾_ẩ￾ )

Trong đó:

x là hàm lượng phenolic acids đo được trong vial, tính bằng ppm (mG/L)

m_cân là khối lượng mẫu cân được, tính bằng gam (G)

m_ẩm là khối lượng ẩm trong mẫu cân = m_cân * %(độ ẩm)

9

3.2. Phương pháp hoạt tính enzyme

Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng

xúc tác được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Đơn vị: U/ml

hoặc U/g.

3.2.1. Xác định hoạt tính enzyme α-amylase [28]

3.2.1.1. Nguyên tắc

Dựa trên sự thủy phân của tinh bột bởi enzyme α-amylase thành dextrin có phân tử

lượng khác nhau trong điều kiện thí nghiệm.

Định nghĩa đơn vị

Một đơn vị hoạt độ tương ứng với 1,0 mg maltose được giải phóng từ quá trình thủy

phân tinh bột trong 30 phút ở pH 5,0 ở 35°C.

Quy trình

Tách chiết enzyme thô: Tiến hành cân 1g mẫu bột vào bình định mức 10ml, định mức

lên 10ml bằng dung dịch đệm 50 mM acetate pH 5,0. Lắc đều và vortex trong 1 phút.

Đem ly tâm 3000 rpm trong 10 phút, phần nổi bên trên là phần dịch chiết enzyme

amylase thô được sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.

Quy trình thực hiện thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme amylase

Bảng 1. Quy trình thực hiện thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme amylase

Mẫu thử Mẫu trắng

Dịch mẫu 0,5ml (đun sôi trong 15

phút – bất hoạt enzyme)

Để nguội

Dung dịch tinh bột 1% 0,5ml (ủ lạnh trong 3-4

phút)

0,5ml

Dịch mẫu 0,5ml

Để trong bể ổn nhiệt ở 35 ̊C, t=30 phút

Dung dịch Acid

dinitrosalicylic (DNS)

0,5ml 0,5ml

Đun trong nước sôi trong 15 phút

Nước cất 9ml 9ml

Lắc đều

Đem đi đo quang ở bước sóng 540nm