Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của vi sinh vật nội sinh từ cây Neem (Azadirachta indica A. Juss)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,

KHÁNG NẤM GÂY BỆNH CỦA

VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ CÂY NEEM

(Azadirachta indica A. Juss)

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ‒ SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVHD: NGUYỄN TRUNG HIẾU

MSSV: 1153010253

NIÊN KHÓA: 2011 ‒ 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

Lời cảm ơn

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy,

cô khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng

dạy và truyền đạt kiến thức cơ bản để giúp tôi làm cơ sở cho đề tài khóa luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn cô Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Văn Minh

đã tận tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý

báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài này.

Tôi xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Mỹ Linh đã luôn quan tâm, giúp đỡ tôi thực

hiện tốt đề tài. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các bạn và các em trong phòng thí

nghiệm Vi sinh luôn ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện suốt đề tài.

Đề tài nghiên cứu kết thúc với những kỷ niệm đẹp và tôi đã học hỏi thêm

được nhiều kinh nghiệm cũng như áp dụng những kiến thức đã học trong nghiên

cứu.

Tôi xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người thầy, người cô đáng kính khoa

Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở Tp. Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày

càng gặt hái được nhiều thành công. Tôi xin chúc các bạn của tôi sẽ hoàn thành tốt

công việc học tập của mình tại trường và thành công trong cuộc sống.

Xin chân thành cảm ơn.

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trung Hiếu

Tháng 05/2015

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG.......................................................................................................I

DANH MỤC BIỂU ĐỒ.................................................................................................II

DANH MỤC HÌNH ẢNH.............................................................................................II

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN..........................................................................................3

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS)..................4

1.1.1. Đặc điểm thực vật học.....................................................................................4

1.1.2. Nguồn gốc và phân bố.....................................................................................4

1.1.3. Đặc điểm hình thái ..........................................................................................5

1.1.4. Công dụng .......................................................................................................6

1.1.5. Dược tính.........................................................................................................7

1.2. SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH.................................................................................8

1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH CHO NGƯỜI.....................10

1.3.1. Staphylococcus aureus..................................................................................10

1.3.2. Escherichia coli.............................................................................................11

1.3.3. Salmonella typhi............................................................................................12

1.3.4. Pseudomonas aeruginosa..............................................................................12

1.3.5. Klebsiella spp. ...............................................................................................13

1.3.6. Acinetobacter spp..........................................................................................14

1.4. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI................................15

1.4.1. Trichophyton spp...........................................................................................16

1.4.2. Microsporum spp...........................................................................................17

1.4.3. Bệnh do dermatophytes gây ra......................................................................17

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU........................................................................................................20

1.5.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .................................................................21

1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước..................................................................21

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU ‒ PHƯƠNG PHÁP ...........................................................23

2.1. VẬT LIỆU............................................................................................................................................24

2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................24

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................24

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường ....................................................24

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................................................................................25

2.2.1. Bố trí thí nghiệm............................................................................................25

2.2.2. Tái phân lập...................................................................................................26

2.2.3. Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây

neem (Azadirachta indica A. Juss)..........................................................................28

2.2.4. Định lượng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của dịch lọc vi khuẩn nội

sinh từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss).......................................................30

2.2.5. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi nấm nội sinh từ cây neem

(Azadirachta indica A. Juss) ...................................................................................32

2.2.6. Khảo sát khả năng kháng nấm của vi nấm nội sinh từ cây neem

(Azadirachta indica A. Juss) ...................................................................................33

2.2.7. Định danh các chủng vi nấm và vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn và

kháng nấm cao theo phương pháp truyền thống.....................................................35

2.2.8. hương pháp thống k số liệu.......................................................................44

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ‒ THẢO LUẬN.................................................................45

3.1. KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP .........................................................................................................46

3.1.1. Vi khuẩn nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss)........................46

3.1.2. Vi nấm nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss)...........................49

3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN

NỘI SINH TỪ CÂY NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS) .................................................51

3.2.1. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật nội sinh từ cây

neem (Azadirachta indica A. Juss)..........................................................................51

3.2.2. Kết quả định lượng khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh

từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss)...............................................................54

3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI

SINH TỪ CÂY NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS)............................................................58

3.3.1. Kết quả định tính khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây neem

(Azadirachta indica A. Juss) ...................................................................................58

3.3.2. Kết quả định lượng khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây

neem (Azadirachta indica A. Juss)..........................................................................60

3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI NẤM NỘI

SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS)..................................61

3.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA VI NẤM NỘI

SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS)..................................66

3.6. ĐỊNH DANH CHỦNG VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,

KHÁNG NẤM CAO NHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY NEEM (AZADIRACHTA INDICA

A. JUSS)..........................................................................................................................................................72

3.6.1. Định danh chủng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao

nhất được phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss) ..............................72

3.6.2. Định danh chủng vi nấm có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao nhất

được phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss).......................................75

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN ‒ ĐỀ NGHỊ ......................................................................78

4.1. KẾT LUẬN..........................................................................................................................................79

4.2. ĐỀ NGHỊ..............................................................................................................................................80

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................81

PHỤ LỤC......................................................................................................................87

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN TRUNG HIẾU i

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số công dụng dược liệu trong các bộ phận của cây neem.......................7

Bảng 2.1. Biểu hiện các mức phát triển của khóm nấm................................................44

Bảng 3. 1. Đặc điểm đại thể và vi thể của vi khuẩn nội sinh từ cây neem ....................46

Bảng 3. 2. Đặc điểm đại thể và vi thể của vi nấm nội sinh từ cây neem .......................49

Bảng 3. 3. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh..................52

Bảng 3. 4. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh..................53

Bảng 3. 5. Kết quả định lượng khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh (mm).....54

Bảng 3. 6. Kết quả định tính khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh.....................59

Bảng 3. 7. Kết quả định tính khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh.....................59

Bảng 3. 8. Kết quả định lượng khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh (mm)........60

Bảng 3. 9. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh với nấm nội sinh phân

lập...................................................................................................................................62

Bảng 3. 10. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh với nấm nội sinh

phân lập ..........................................................................................................................62

Bảng 3. 11. Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn gây bệnh của các chủng vi nấm

nội sinh phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss) (mm)...............................64

Bảng 3. 12. Kết quả định tính khả năng kháng nấm gây bệnh của các chủng nấm nội

sinh phân lập ..................................................................................................................67

Bảng 3. 13. Kết quả định tính khả năng kháng nấm gây bệnh của các chủng nấm nội

sinh .................................................................................................................................67

Bảng 3. 14. Kết quả xác định phần trăm ức chế T. rubrum của các chủng nấm nội

sinh thử nghiệm phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss)............................68

Bảng 3. 15. Kết quả xác định phần trăm ức chế T. mentagrophytes của các chủng

nấm nội sinh thử nghiệm phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss)..............69

Bảng 3. 16. Kết quả xác định phần trăm ức M. gypseum của các chủng nấm nội sinh

thử nghiệm phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss) ...................................70

Bảng 3. 17. Kết quả xác định phần trăm ức chế vi nấm gây bệnh của các chủng nấm

nội sinh thử nghiệm phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss) (%)...............71

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN TRUNG HIẾU ii

Bảng 3. 18. Kết quả định danh sinh hóa chủng KT1, KT2 và KT3...............................74

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. So sánh khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh ................56

Biểu đồ 3.2. So sánh khả năng kháng T. rubrum của KT1, KT2 và KT3......................60

Biểu đồ 3. 3. So sánh khả năng kháng khuẩn của vi nấm nội sinh NT2 và NL1...........64

Biểu đồ 3. 4. So sánh phần trăm ức chế vi nấm gây bệnh với vi nấm nội sinh NT1,

NT2 và NL1 từ cây neem...............................................................................................71

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 3. 1. Kết quả quan sát đại thể và vi thể của vi khuẩn KT1 nội sinh.................48

Hình 3.2. Kết quả quan sát đại thể và vi thể của vi khuẩn KT2 nội sinh..................48

Hình 3.3. Ảnh đại thể vi nấm NT2 nội sinh từ cây neem .........................................51

Hình 3. 4. Ảnh đại thể vi nấm NL1 nội sinh từ cây neem ........................................51

Hình 3.5. Kết quả định lượngkhả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các vi khuẩn

nội sinh từ cây neem..................................................................................................58

Hình 3.6. Kết quả kháng nấm T. rubrum của các chủng KT1, KT2 và KT3............61

Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng vi nấm nội sinh kháng P. aeruginosa. ...........65

Hình 3.8. Nấm T. rubrum đối chứng........................................................................68

Hình 3.9. Chủng NT1 kháng nấm T. rubrum............................................................69

Hình 3.10. Nấm T. mentagrophytes đối chứng .........................................................69

Hình 3.11. Chủng NL1 kháng T. mentagrophytes....................................................70

Hình 3.12. Nấm M. gypseum đối chứng...................................................................70

Hình 3.13. Chủng NT2 kháng M. gypseum...............................................................71

Hình 3.14. Kết quả nhuộm Gram và hình thái khuẩn lạc trên môi trường NA của..73

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN TRUNG HIẾU iii

Hình 3.15. Kết quả nhuộm Gram và hình thái khuẩn lạc trên môi trường NA của

chủng KT2.................................................................................................................73

Hình 3.16. Kết quả nhuộm Gram và hình thái khuẩn lạc trên môi trường NA của

chủng KT3.................................................................................................................74

Hình 3.17. Quan sát hình thái nấm NT2 trên môi trường PDA................................76

Hình 3.18. Bào tử chủng NT2 dưới kính hiển vi ......................................................76

Hình 3.19. Quan sát hình thái nấm NL1 trên môi trường PDA................................77

Hình 3.20. Bào tử chủng NL1 dưới kính hiển vi .....................................................77

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Bố trí thí nghiệm...........................................................................................26

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN TRUNG HIẾU iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc

Cs Cộng sự

E. coli Escherichia coli

ESBL Extend Spectra Beta – Lactamases

I (%) Phần trăm ức chế

M. canis Microsporum canis

M. gypseum Microsporum gypseum

NA Nutrient Agar

NB Nutrient Broth

OD Optical Density

PDA Potato Dextrose Agar

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

SDA Sabouraud Dextrose Agar

S. aureus Staphylococcus aureus

S. typhi Samonella typhi

T. mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes

T. rubrum Trichophyton rubrum

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN TRUNG HIẾU 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam không được kiểm soát chặt

chẽ, người bệnh tự ý sử dụng mà không theo hướng dẫn của bác sĩ khiến vi khuẩn

phơi nhiễm nhiều kháng sinh dẫn đến vi khuẩn kháng thuốc phát triển và lây lan.

Sự gia tăng tình trạng kháng kháng sinh có thể dẫn đến nguy cơ không còn kháng

sinh để điều trị nhiễm khuẩn trong tương lai ( GARP ‒ Vietnam, 2010).

Một trong những hướng giải pháp mới được đề ra là tìm các hợp chất có nguồn

gốc từ thực vật. Hiện nay cùng với sự phát triển của y học, các bài thuốc từ thực

vật được sử dụng để chữa bệnh ngày càng nhiều. Các loài thực vật này có trong tự

nhiên, dễ kiếm lại ít có những tác dụng phụ cho con người, do đó đã thu hút sự

quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên

thế giới (Võ Thị Mai Hương, 2009). Bên cạnh đó, một số nghiên cứu trước đây đã

cho thấy rằng, vi khuẩn nội sinh thực vật có khả năng sinh ra các chất có khả năng

ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có

tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây

bệnh (Ryan và cs., 2008).

Trong rất nhiều hợp chất có nguồn gốc từ thực vật thì các hợp chất chiết xuất

từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss), một loại thảo dược từ cổ xưa có nguồn

gốc ở Ấn Độ đã và đang được quan tâm bởi những công dụng to lớn của nó đối

với sức khỏe và đời sống con người. Tại Việt Nam, cây neem mọc hoang và trồng

nhiều ở các tỉnh miền Nam Trung Bộ như Bình Thuận, Ninh Thuận.

Cây neem có các hợp chất chống viêm, chống ung thư, chống khối u, kháng

virus, kháng khuẩn, kháng nấm và kháng kí sinh trùng, giúp ngăn chặn sự hình

thành các tế bào bất thường, loại trừ bệnh nhiễm trùng và đẩy nhanh sự chữa lành

trong rất nhiều vấn đề sức khỏe như nimbin, nimbinon, margocin, azadirachtin...

(Võ Quang Yến, 1996; Conrick, 2001). Năm 2012, Hashmat và cộng sự đã khảo sát

cao chiết cây neem bằng methanol có khả năng ức chế Bacillus subtilis với đường

kính kháng 28 mm. Năm 2007, Chandrashekhara và cộng sự đã phân lập được 7

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN TRUNG HIẾU 2

chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ cây neem tại Ấn Độ cho thấy 2 chủng

Gram (+) và 5 chủng Gram (). Năm 2008, Rajasekaran đã nghiên cứu cao chiết lá

neem bằng dung môi nước, ethanol và dichloromethane đều cho thấy hoạt tính

kháng 10 chủng vi khuẩn gây bệnh. Năm 2009, Verma và cộng sự đã phân lập được

55 chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây neem có khả năng ức chế được 54,4% hoạt động

của vi khuẩn và nấm bệnh.

Với những công dụng to lớn như trên nhưng tại Việt Nam cây neem vẫn chưa

được nghiên cứu sâu và rộng rãi. Sự hiểu biết các nghiên cứu về cây neem ở nước ta

cho đến thời điểm hiện tại chỉ dừng ở mức độ tách chiết và cô đặc các hợp chất từ

cây neem mà không có nhiều nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh từ cây neem. Để tận

dụng và phát triển nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, nhằm đem đến nhiều lựa

chọn hơn cho vấn đề sức khỏe của con người và động vật chúng tôi quyết định tiến

hành thực hiện đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các

chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss)”.

 Mục tiêu

Khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của một số chủng vi sinh vật nội

sinh từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss).

 Nội dung thực hiện bao gồm

 Tái phân lập các chủng vi sinh vật nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica

A. Juss).

 Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của một số chủng vi sinh vật

nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss).

 Định lượng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của một số chủng vi sinh vật

nội sinh từ cây neem (Azadirachta indica A. Juss).

 Định danh các chủng vi sinh vật nội sinh từ cây neem có hoạt tính kháng

khuẩn, kháng nấm cao nhất bằng phương pháp truyền thống.