Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ cây vối (Cleistocalys Operculatus Roxb)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TPHCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,

KHÁNG NẤM GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN

NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY VỐI

(Cleistocalyx operculatus Roxb)

Khoa công nghệ sinh học

Chuyên ngành: vi sinh- sinh học phân tử

GVHD: Th.S Dương Nhật Linh

SVTH: Nguyễn Thị Thảo

MSSV: 1153010754

Niên Khóa: 2011- 2015

TP. Hồ Chí Minh ngày 05 tháng 5 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến các quý thầy, cô khoa

Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và

truyền đạt kiến thức cơ bản để giúp em làm cơ sở cho đề tài nghiên cứu.

Em xin gửi lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Cô Dương Nhật Linh đã tận

tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, tạo

mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt trong suốt thời gian thực hiện đề tài

này.

Em xin chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh và những người anh,

người chị luôn ủng hộ, giúp đỡ em trong lúc làm đề tài nghiên cứu.

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các bạn của tôi, các bạn sinh viên phòng thí

nghiệm công nghệ vi sinh – sinh học phân tử đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt

quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng con xin cảm ơn Cha Mẹ, cảm ơn gia đình đã luôn bên con, tạo mọi

điều kiện tốt nhất để con hoàn thành việc học của mình.

Hoàn thành đề tài nghiên cứu cùng với những kỷ niệm đẹp và tôi đã học hỏi

thêm được nhiều kinh nghiệm cũng như áp dụng những kiến thức đã học trong

nghiên cứu.

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người thầy, người cô đáng kính khoa

Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở TP. Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày

càng gặt hái được nhiều thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống.

Tôi xin chúc các bạn của tôi sẽ hoàn thành tốt công việc học tập của mình tại

trường và thành công trong cuộc sống.

Xin chân thành cảm ơn Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thảo

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO i

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1.Minh họa vòng kháng khuẩn, kháng nấm………………………………… 31

Hình 3.1. Hình phân lập vi khuản nội sinh từ cây vối……………………………… 50

Hình 3.2. Hình ảnh đại thể, vi thể chủng BDL7.3………………………………….50

Hình 3.3. Hình ảnh đại thể, vi thể chủng BDT2……………………………………. 51

Hình 3.4. Hình ảnh đại thể, vi thể chủng BDR3……………………………………... 51

Hình 3.5. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng Escherichia coli…………………………..55

Hình 3.6. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng Staphylococcus aureus…………………...55

Hình 3.7. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng Samonella typhi…………………………..56

Hình 3.8. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng vi nấm T. mentagrophytes………………..60

Hình 3.9. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng vi nấm T. rubrum………………………... 61

Hình 3.10. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng vi nấm M. gypseum…………………….. 61

Hình 3.11. Khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của cao chiết……………………….. 71

Hình 3.12. Khả năng kháng vi nấm gây bệnh của cao chiết…………………………. 75

Hình 3.13. Kết quả MIC của mẫu cao chiết lá vối chiết bằng methanol kháng vi khuẩn

gây bệnh……………………………………………………………………………... 78

Hình 3.14. Kết quả MIC của mẫu cao chiết lá vối chiết bằng ethanol kháng vi khuẩn

gây bệnh……………………………………………………………………………… 79

Hình 3.15. Kết quả MIC của mẫu cao chiết lá vối chiết bằng methanol kháng vi nấm

gây bệnh……………………………………………………………………………… 80

Hình 3.16. Kết quả MIC của mẫu cao chiết lá vối chiết bằng ethanol kháng vi nấm gây

bệnh…………………………………………………………………………………... 81

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG

SVTH:NGUYỄN THỊ THẢO ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.Hàm lượng tinh dầu vối ở các địa phương của Nghệ An………………….. 8

Bảng 1.2. Thành phần hóa học tinh dầu vối…………………………………………..8

Bảng 3.1. Kết quả quan sát đại thể,vi thể vi khuẩn nội sinh từ cây vối………………47

Bảng 3.2. Kết quả định tính khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn nội sinh

phân lập từ cây vối……............................................................................................... 53

Bảng 3.3. Đường kính vòng kháng vi khuẩn của khuẩn nội sinh từ

cây…………………………………………………………………………………....56

Bảng 3.4. Kết quả định tính khả năng kháng vi nấm gây bệnh của vi khuẩn nối sinh từ

cây vối……………………………………………………………………………… 58

Bảng 3.5. Đường kính vòng kháng vi nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây

vối……………………………………………………………………………………. 62

Bảng 3.6. Kết quả định danh sinh hóa chủng vi khuẩn nội sinh…………………….. 64

Bảng 3.7. Khối lượng cao chiết thu được bằng các dung môi khác nhau…………… 65

Bảng 3.8. Kết quả số lượng nấm và khuẩn sống có trong cao chiết…………………. 67

Bảng 3.9. Kết quả định tính của cao chiết kháng khuẩn………….…………………. 68

Bảng 3.10. Đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết từ lá vối………………………69

Bảng 3.11. Kết quả định tính khả năng kháng nấm của cao chiêt…………………… 72

Bảng 3.12. Đường kính vòng kháng nấm của cao chiết từ lá vối……………………. 73

Bảng 3.13. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết kháng vi sinh vật………. .76

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC

SVTH:NGUYỄN THỊ THẢO iii

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Quy trình thí nghiệm............................................................................. 26

Sơ đồ 2.2. Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dược liệu………………………... 46

DANG MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết thu được từ lá….66

Biểu đồ 3.2. So sánh kết quả kháng khuẩn của các loại cao chiết từ lá vối………. 70

Biểu đồ 3.3. So sánh kết quả kháng nấm của các loại cao chiết từ lá vối………… 74

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

SVTH:NGUYỄN THỊ THẢO iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA One-way analysis of variance

CFU Colony forming unit- đơn vị hình thành khuẩn lạc

Cs Cộng sự

DMSO Dimethyl sulfoxid

E. coli Escherichia coli

MHA Muller Hinton Agar

M. gypseum Microsporum gypseum

MIC Minimum Inhibtory Concetration- Nồng độ ức chế tối thiểu

NA Nutrient Agar

NB Nutrient Broth

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

PDA Potato Dextrose Agar

S. aureus Staphylococcus aureus

SDA Sabouraud Dextrose Agar

SE Standard Error

S. typhi Salmonella typhi

TSA Trypticase Soy Agar

T. rubrum Trichophyton rubrum

T. mentagrophytes Trichophytonmentagrophytes

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO v

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................1

PHẦN I:.............................................................................................................................3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................................................3

1.1.TỔNG QUAN VỀ CÂY VỐI (Cleistocalyx operculatus Roxb) ................................4

1.1. Giới thiệu chung về cây vối (Cleistocalyx operculatus Roxb)...............................4

1.1.1. Đặc điểm thực vật học..............................................................................................4

1.1.2. Phân bố.....................................................................................................................5

1.1.3.Công dụng của cây vối..............................................................................................5

1.1.4. Dược tính..................................................................................................................6

1.1.5. Thành phần hóa học .................................................................................................7

1.2. TỔNG QUAN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI ......................11

1.2.1. Escherichia coli.....................................................................................................11

1.2.2. Salmonella typhi ....................................................................................................12

1.2.3. Staphylococcus aureus ..........................................................................................12

1.2.4. Pseudomonas aeruginosa......................................................................................13

1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI .....................14

1.3.1. Dermatophytes.......................................................................................................14

1.3.1.1. Microsporum gypseum .......................................................................................14

1.3.1.2. Microsporum canis.............................................................................................15

1.3.1.3. Trichophyton.......................................................................................................16

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ...................................17

1.4.1. Ngoà

i nước ............................................................................................................17

1.4.2. Trong nước ............................................................................................................17

1.5. KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU ..........................18

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO vi

1.5.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation)................................................................18

1.5.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)...............................................................19

1.5.3. Kỹ thuật chiết Sohxlet .........................................................................................20

1.5.4. Cô đặc và sấy khô................................................................................................21

1.6. KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,

KHÁNG NẤM ................................................................................................................22

1.6.1 Phương pháp khuếch tán .......................................................................................22

1.6.1.1. Nguyên tắc .........................................................................................................22

1.6.1.2 Môi trường cơ bản thực hiện thử nghiệm...........................................................22

1.6.1.3. Phương pháp pha loãng liên tiếp ....................................................................22

PHẦN II: .........................................................................................................................24

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG ..............................................................................................24

PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................................................24

2.1.VẬT LIỆU.................................................................................................................25

2.1.1.Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..........................................................................25

2.1.2.Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................25

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường ............................................................25

2.1.3.1. Thiết bị và dụng cụ.............................................................................................25

2.1.3.2. Hóa chất..............................................................................................................25

2.1.3.3. Môi trường..........................................................................................................26

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................26

2.2.1. Bố trí thí nghiệm....................................................................................................26

2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây vối......................................27

2.2.2.1. Thu nhận mẫu.....................................................................................................27

2.2.2.2. Xử lý mẫu ...........................................................................................................27

2.2.2.3. Phân lập vi khuẩn nội sinh ...............................................................................27

2.2.2.4. Làm thuần...........................................................................................................28

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO vii

2.2.2.5. Quan sá

t đai th ̣ ể, vi thể.......................................................................................28

2.2.3. Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm vi khuẩn nội sinh. .........................29

2.2.3.1. Chuẩn bị môi trường:.........................................................................................29

2.2.3.2. Chuẩn bị dịch vi sinh vật thử nghiệm.................................................................29

2.2.4. Định danh vi khuẩn nội sinh bằng thử nghiệm sinh hóa .....................................32

2.2.4.1 Nhuộm gram ........................................................................................................32

2.2.4.2. Thử nghiệm catalase..........................................................................................32

2.2.4.3. Indol...................................................................................................................32

2.2.4.4.Amylase................................................................................................................33

2.2.4.5. Nitrate.................................................................................................................33

2.2.4.6. Citrate................................................................................................................34

2.2.4.7. Urease.................................................................................................................35

2.2.4.8. Voges – Proskauer (VP)....................................................................................35

2.2.7.8. Các thử nghiệm lên men đường .......................................................................36

2.2.4.9. Phát triển ở 10% NaCl.......................................................................................36

2.2.4.10. Khả năng phát triển ở 50oC............................................................................36

2.2.4.11. Kiểm tra khả năng phát triển ở điều kiện kỵ khí ............................................37

2.2.4.12. Thủy phân casein............................................................................................38

2.2.4.13. Xác định khả năng di động.............................................................................38

2.2.5. Phương pháp chiết xuất cao dược liệu từ lá vối ....................................................39

2.2.6. Định tính khả năng kháng khuẩn kháng nấm của cao chiết từ lá cây vối .............41

2.2.7. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn và vi nấm

gây bệnh...........................................................................................................................42

2.2.7.1. Đối với vi khuẩn gây bệnh..................................................................................42

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO viii

2.2.7.2. Đối với vi nấm gây bệnh: ...................................................................................44

PHẦN III........................................................................................................................45

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................................45

3.1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY THUỐC ........................46

3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÂY VỐI............................46

3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM GÂY

BỆNH CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY VỐI..................52

3.3.1. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh ..............................................51

3.3.2. Kết quả định tính khả năng kháng vi nấm gây bệnh ............................................58

3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH SINH HÓA CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH....63

3.5. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI CHIẾT ĐẾN KHỐI

LƯỢNG CAO CHIẾT THU ĐƯỢC TỪ LÁ CÂY VỐI ................................................65

3.6. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT

TỪ LÁ CÂY VỐI............................................................................................................67

3.6.1. Kết quả định tính khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của cao chiết từ lá cây vối

.........................................................................................................................................67

3.6.2. Kết quả định tính khả năng kháng nấm gây bệnh của cao chiết từ lá cây vối .....71

3.7. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT........76

PHẦN IV: KẾT LUÂN V ̣ À ĐỀ NGHI................................ ̣ ..........................................82

4.1. KẾT LUẬN ..............................................................................................................83

4.2. ĐỀ NGHỊ..................................................................................................................85

TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................86

PHỤ LỤC........................................................................................................................92

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẶT VẤN ĐỀ

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO 1

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới nóng ẩm với nguồn dược liệu phong phú

và đa dạng. Theo thống kê Võ Văn Chi (1971) nước ta có khoảng 3200 loài cây thuốc

trong 10.000 loài thực vật ở Việt Nam.

Thuốc chữa bệnh là thành phần không thể thiếu được trong cuộc sống. Từ xa

xưa đến nay, con ngưới biết sử dụng cây cỏ vào việc điều trị bệnh. Mặc dù các loại

thuốc tây y chiếm một phần lớn trong phương pháp điều trị nhưng thuốc có nguồn

gốc thảo dược vẫn đứng một vị trí hết sức quan trọng (Võ Thị Mai Hương, 2012).

Một trong những hướng nghiên cứu mới hiện nay là tìm các hợp chất có nguồn

gốc từ thực vật có tác nhân kháng nấm, kháng khuẩn. Hiện nay cùng với sự phát triển

của y học, các bài thuốc từ thực vật được sử dụng để chữa bệnh ngày càng nhiều. Bên

cạnh đó, một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, vi khuẩn nội sinh thực vật có

khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn

chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các

loại nấm và vi khuẩn gây bệnh (Ryan và cs., 2008). Các loài thực vật này có trong tự

nhiên, dễ kiếm lại ít có những tác dụng phụ cho con người, do đó đã thu hút sự quan

tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế

giới (Võ Thị Mai Hương, 2009).

Trong rất nhiều thực vật với mục đích chữa bệnh cây vối là một thảo dược an

toàn trong điều trị bệnh. Năm 2008, Kang và cộng sự, đã nghiên cứu và cho thấy tinh

dầu nụ vối (Cleistocalyx operculatus buds) chống lại tất cả các vi sinh vật thử nghiệm

bao gồm cả vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm Candida albicans với đường kính

của vòng kháng 8-16 mm. Trong khi đó, chiết xuất ethanol từ nụ vối (Cleistocalyx

operculatus buds) ức chế chống hoạt động toàn bộ vi khuẩn Gram dương, và chỉ có một

trong những loại vi khuẩn Gram âm là P. aeruginosa, đường kính vòng kháng 18-22

mm. Bên cạnh đó nghiên cứu còn cho thấy tinh dầu và ethanol chiết xuất từ

ĐẶT VẤN ĐỀ