Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ cây dược liệu Tô Mộc (Caesalpinia sappan L.)

BỘ GIÁO DỤC – ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,

KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ

CAO CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU TÔ MỘC

(Caesalpinia sappan L.)

Chuyên ngành: Vi sinh – SHPT

GVHD: ThS. Dương Nhật Linh

SVTH: Nguyễn Thời Thịnh

MSSV: 1153010789

Khóa: 2011 – 2015

Bình Dương, tháng 05 năm 2015

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

LỜI CẢM ƠN

Sau những ngày khóa luận tốt nghiệp vừa qua, em đã nhận được rất nhiều kiến

thức, kinh nghiệm trong thực hành nhờ vào sự giúp đỡ và chỉ dạy rất nhiệt tình của các

cô, các chị để em có thể hoàn thành tốt phần thực tập của mình. Nay em xin được gửi

lời tri ân tới:

Cô Dương Nhật Linh đã giành nhiều thời gian, tâm huyết, trực tiếp truyền đạt

cho em nhiều kiến thức bổ ích, luôn tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành tốt

đợt thực tập này.

Các thầy cô thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Ngành vi sinh, SHPT – Trường

ĐH Mở TP.HCM đã truyền dạy cho em những kiến thức nền tảng để em có thể vận

dụng trong kỳ thực tập này.

Chị Nguyễn Thị Mỹ Linh đã quan tâm, chia sẻ cho em nhiều kinh nghiệm quý

báu trong thực hành cũng như đã hết lòng giúp đỡ em hoàn thành phần thực tập của

mình.

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các bạn của tôi, các bạn sinh viên phòng thí nghiệm

công nghệ vi sinh – sinh học phân tử đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực

hiện đề tài.

Lời tri ân cuối xin chân thành gửi tới cha mẹ đã là chỗ dựa vững chắc cho con,

tạo mọi điều kiện tốt nhất trên con đường học tập và phát triển.

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người thầy, người cô đáng kính khoa

Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở TP. Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày

càng gặt hái được nhiều thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống.

Xin chân thành cảm ơn! Bình Dương, ngày 05 tháng 05 năm 2015

SVTH

Nguyễn Thời Thịnh

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT ...............................................................................................I

DANH MỤC BẢNG......................................................................................................II

DANH MỤC HÌNH ẢNH...........................................................................................III

DANH MỤC SƠ ĐỒ ...................................................................................................IV

DANH MỤC BIỂU ĐỒ............................................................................................... IV

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................5

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.).................................6

1.1.1. Vị trí phân loại cây tô mộc.............................................................................6

1.1.2. Đặc điểm thực vật ..........................................................................................6

1.1.3. Phân bố, trồng trọt và thu hái.........................................................................7

1.1.4. Tác dụng trị liệu theo kinh nghiệm nhân gian ...............................................7

1.1.5. Dược tính........................................................................................................8

1.1.6. Nghiên cứu về hóa học...................................................................................9

1.2. SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH.......................................................................12

1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI......................................12

1.3.1. Escherichia coli............................................................................................12

1.3.2. Salmonella typhi...........................................................................................13

1.3.3. Pseudomonas aeruginosa ............................................................................14

1.3.4. Staphylococcus aureus.................................................................................15

1.4. KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU........................16

1.4.1. Các loại cao dược liệu..................................................................................16

1.4.2. Kỹ thuật chiết Soxhlet..................................................................................16

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI ............................................19

1.5.1. Thế giới ........................................................................................................19

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

1.5.2. Trong nước ...................................................................................................20

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................21

2.1. VẬT LIỆU...........................................................................................................22

2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................22

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................22

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường ...................................................22

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................23

2.2.1. Bố trí thí nghiệm ..........................................................................................23

2.2.2. Xác định tên khoa học của cây thuốc...........................................................25

2.2.3. Quy trình thu nhận và xử lý mẫu .................................................................25

2.2.4. Phân lập và làm thuần vi sinh vật nội sinh...................................................26

2.2.5. Khảo sát đại thể và vi thể các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được .......26

2.2.6. Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây tô

mộc (Caesalpinia sappan L.).................................................................................27

2.2.7. Định lượng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của dịch lọc vi khuẩn nội

sinh từ cây tô mộc (Caesalpinia sappan L.)..........................................................29

2.2.8. Phương pháp chiết xuất cao dược liệu từ cây tô mộc

(Caesalpinia sappan L.).........................................................................................31

2.2.9. Thử giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết .....................................................33

2.2.10. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây tô mộc

(Caesalpinia sappan L.).........................................................................................34

2.2.11. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây

bệnh ........................................................................................................................35

2.2.12. Định danh vi khuẩn nội sinh bằng test sinh hóa ........................................37

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................45

3.1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.)

....................................................................................................................................46

3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH .................................................46

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN NỘI

SINH TỪ CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.)..................................................50

3.3.1. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật nội sinh từ cây tô

mộc .........................................................................................................................50

3.3.2. Kết quả định lượng khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ

cây tô mộc ..............................................................................................................53

3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI

SINH TỪ CÂY TÔ MỘC(CAESALPINIA SAPPAN L.)...................................................56

3.4.1. Kết quả định tính khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây tô mộc

................................................................................................................................56

3.4.2. Kết quả định lượng khả năng kháng nấm của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ

cây tô mộc ..............................................................................................................57

3.5. ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CAO

NHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY TÔ MỘC...................................................................60

3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI CHIẾT ĐẾN KHỐI LƯỢNG CAO

CHIẾT THU ĐƯỢC TỪ CÂY TÔ MỘC ..............................................................................61

3.7. KẾT QUẢ THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT......................................63

3.8. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY TÔ MỘC

....................................................................................................................................64

3.9. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT......66

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................69

4.1. KẾT LUẬN .........................................................................................................70

4.2. ĐỀ NGHỊ.............................................................................................................71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................72

PHỤ LỤC......................................................................................................................79

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH i

DANH MỤC VIẾT TẮT

CFU Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc

Cs. Côṇ g sự

E. coli Escherichia coli

M. canis Microsporum canis

M. gypseum Microsporum gypseum

MHA Muller Hinton agar

MRSA Methicillin – resistant Staphylococcus aureus là vi khuẩn

gram dương mọc thành cụm như chùm nho, sự tăng trưởng

của MRSA không bị ức chế bởi methicillin, oxacillin và

nhiều kháng sinh khác.

MIC Minimum Inhibitory Concetration – Nồng độ ức chế tối

thiểu

NA Nutrient Agar

NB Nutrient Broth

NXB Nhà xuất bản.

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

S. aureus Staphylococcus aureus

S. typhi Salmonella Typhi

T. mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes

T. rubrum Trichophyton rubrum

TSA Trypticase Soy Agar

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết Soxhlet.......................................17

Bảng 2.1. Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh của chất thử (MIC)....................................36

Bảng 3.1. Kết quả quan sát đại thể và vi thể của vi khuẩn nội sinh từ cây tô mộc........46

Bảng 3.2. Kết quả định tính khả năng kháng vi khuẩn bệnh của vi khuẩn nội sinh......51

Bảng 3.3. Kết quả định lượng khả năng kháng khuẩn gây bệnh của dịch lọc vi khuẩn

nội sinh (mm) .................................................................................................................53

Bảng 3.4. Kết quả định tính khả năng kháng nấm bệnh của vi khuẩn nội sinh.............56

Bảng 3.5. Kết quả định lượng khả năng kháng nấm bệnh của dịch lọc vi khuẩn nội sinh

(mm)...............................................................................................................................58

Bảng 3.6. Kết quả định danh sinh hóa chủng nội sinh...................................................61

Bảng 3.7. Khối lượng cao chiết thu được bằng các dung môi khác nhau......................62

Bảng 3.8. Kết quả số lượng nấm và vi khuẩn sống còn lại trong cao chiết từ cây tô

mộc.................................................................................................................................63

Bảng 3.9. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao chiết từ cây tô mộc.........................64

Bảng 3.10. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ vỏ thân cây tô mộc

kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh (µg/ mL)............................................................67

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái và giải phẫu của cây tô mộc .............................................6

Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây tô mộc .....................11

Hình 1.3. Túi chứa dược liệu và bộ chiết Soxhlet..........................................................18

Hình 2.1. Kết quả vòng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh .........................................29

Hình 2.2. Kết quả kháng vi khuẩn, vi nấm bằng phương pháp khuếch tán qua giếng

thạch ...............................................................................................................................31

Hình 3.1. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu thân (A) và rễ (B) của cây tô mộc.

(C) Đĩa đối chứng...........................................................................................................48

Hình 3.2. Kết quả quan sát đại thể và vi thể của vi khuẩn VT8 nội sinh.......................49

Hình 3.3. Kết quả quan sát đại thể và vi thể của vi khuẩn VT6 nội sinh.......................49

Hình 3.4. Kết quả khả năng thử đối kháng chủng vi khuẩn nội sinh từ cây tô mộc ......52

Hình 3.5. Kết quả định lượng vòng kháng vi khuẩn gây bệnh của dịch lọc vi khuẩn nội

sinh từ cây tô mộc. .........................................................................................................54

Hình 3.6. Kết quả định lượng vòng kháng vi nấm gây bệnh của dịch lọc vi khuẩn nội

sinh từ cây tô mộc ..........................................................................................................59

Hình 3.7. Kết quả nhuộm gram và hình thái khuẩn lạc trên môi trường NA của chủng

VT7.................................................................................................................................60

Hình 3.8. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây tô mộc......................................66

Hình 3.9. Kết quả MIC của mẫu cao chiết từ cây tô mộc bằng dung môi ethanol kháng

khuẩn gây bệnh ..............................................................................................................67

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH iv

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Quy trình thí nghiệm.....................................................................................24

Sơ đồ 2.2. Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dược liệu ............................................32

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. So sánh khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây tô

mộc .................................................................................................................................54

Biểu đồ 3.2. So sánh khả năng kháng nấm của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây

tô mộc.............................................................................................................................58

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết thu được từ thân

cây tô mộc ......................................................................................................................62

Biểu đồ 3.4. Kết quả kháng khuẩn của các loại cao chiết từ cây tô mộc.......................65

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 1

ĐẶT VẤN ĐỀ