Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ cây dược liệu Sâm Đại Hành (Eleutherine subaphylla Gagnep)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,

KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ

CAO CHIẾT TỪ CÂY DƢỢC LIỆU SÂM ĐẠI

HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: ThS. Dƣơng Nhật Linh

SVTH: Lê Thị Mai Thảo

MSSV: 1153010749

Niên khóa: 2011 - 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH

SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô khoa Công Nghệ

Sinh Học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt

kiến thức cho em trong suốt những năm vừa qua.

Em xin gửi lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến cô Dương Nhật Linh đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và tạo điều kiện thuận

lợi để em hoàn thành tốt trong suốt thời gian thực hiện đề tài này.

Em xin cảm ơn chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh và các chị trong

phòng thí nghiệm đã luôn ủng hộ, giúp đỡ em trong lúc làm đề tài.

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các bạn của tôi, các bạn trong nhóm làm đề tài và các

em sinh viên học việc phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh đã luôn quan tâm, giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài này.

Cuối cùng con xin cảm ơn Ông Bà, Cha Mẹ, cảm ơn gia đình đã luôn bên con, tạo

mọi điều kiện tốt nhất để con hoàn thành việc học của mình.

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người thầy, người cô đáng kính khoa Công

nghệ sinh học, Trường Đại học mở thành phố Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày

càng gặt hái được nhiều thành công.

Xin chân thành cảm ơn.

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Mai Thảo

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH

SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)................................8

Hình 2 1 Kết quả vòng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán

qua giếng thạch .........................................................................................................31

Hình 3 1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trên đĩa TSA ................................................48

Hình 3 2 Hình ảnh quan sát đại thể và vi thể một số chủng vi khuẩn nội sinh......49

Hình 3 3 Kết quả thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh E. coli 52

Hình 3 4 Kết quả thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh S. aureus

...................................................................................................................................53

Hình 3 5 Kết quả thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh S. typhi

...................................................................................................................................54

Hình 3 6 Kết quả thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi nấm gây bệnh T. rubrum

...................................................................................................................................58

Hình 3 7 Kết quả thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi nấm gây bệnh

T. mentagrophytes.....................................................................................................58

Hình 3 8 Kết quả thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi nấm gây bệnh

M. gypseum ...............................................................................................................59

Hình 3 9 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết từ củ sâm đại hành

...................................................................................................................................67

Hình 3 10 Kết quả thử hoạt tính kháng nấm của cao chiết từ củ sâm đại hành.....70

Hình 3 11 Kết quả MIC của cao chiết từ củ sâm đại hành bằng dung môi

chloroform.................................................................................................................73

Hình 3 12 Kết quả MIC của cao chiết từ củ sâm đại hành bằng dung môi methanol

...................................................................................................................................74

Hình 3 13 Kết quả MIC của cao chiết từ củ sâm đại hành bằng dung môi methanol

...................................................................................................................................75

Hình 3 14 Kết quả MIC của cao chiết từ củ sâm đại hành bằng dung môi ethanol

...................................................................................................................................75

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH

SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3 1 Kết quả quan sát đại thể và vi thể các chủng vi khuẩn nội sinh .............46

Bảng 3 2 Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh của vi khuẩn nội sinh

...................................................................................................................................50

Bảng 3 3 Kết quả định lượng khả năng kháng khuẩn gây bệnh của vi khuẩn nội

sinh ............................................................................................................................55

Bảng 3 4 Kết quả định tính khả năng kháng nấm gây bệnh của vi khuẩn nội sinh

...................................................................................................................................56

Bảng 3 5 Kết quả đường kính vòng kháng nấm gây bệnh của các vi khuẩn nội sinh

...................................................................................................................................60

Bảng 3 6 Kết quả định danh sinh hóa chủng vi khuẩn nội sinh TC20...................61

Bảng 3 7 Kết quả định danh sinh hóa chủng vi khuẩn nội sinh TL19...................62

Bảng 3 8 Khối lượng cao chiết thu được bằng các dung môi khác nhau...............63

Bảng 3 9 Kết quả số lượng nấm và vi khuẩn sống có trong cao chiết...................64

Bảng 3 10 Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của cao chiết từ củ sâm đại

hành ...........................................................................................................................65

Bảng 3 11 Kết quả đường kính kháng nấm của cao chiết từ củ sâm đại hành ......67

Bảng 3 12 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ củ sâm đại

hành đối với các chủng vi sinh vật gây bệnh ............................................................71

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH

SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO v

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2 1 Quy trình thí nghiệm...........................................................................26

Sơ đồ 2 2 Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dược liệu....................................32

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3 1 Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết .........................63

Biểu đồ 3 2 So sánh kết quả kháng khuẩn của các loại cao chiết từ củ sâm đại

hành ......................................................................................................................66

Biểu đồ 3 3 So sánh kết quả kháng nấm của các loại cao chiết từ củ sâm đại hành

..............................................................................................................................68

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH

SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA One-way analysis of variance

CFU Colony forming unit- đơn vị hình thành khuẩn lạc

Cs Cộng sự

DMSO Dimethyl sulfoxid

E. coli Escherichia coli

MHA Muller Hinton Agar

M. gypseum Microsporum gypseum

MIC Minimum Inhibtory Concetration - Nồng độ ức chế tối

thiểu

NA Nutrient Agar

NB Nutrient Broth

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

PDA Potato Dextrose Agar

S. aureus Staphylococcus aureus

SDA Sabouraud Dextrose Agar

SE Standard Error

S. typhi Salmonella typhi

TSA Trypticase Soy Agar

T. rubrum Trichophyton rubrum

T. mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH

SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO vii

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH......................................................................................III

DANH MỤC BẢNG............................................................................................... IV

DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................V

DANH MỤC BIỂU ĐỒ............................................................................................V

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. VI

MỤC LỤC..............................................................................................................VII

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................4

1.1. S L ỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH ......................................................5

1.1.1. Phân loại vi sinh vật nội sinh............................................................6

1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và đa dạng sinh học của vi sinh vật nội sinh..6

1.2. S L ỢC VỀ CÂY SÂM ĐẠI HÀNH ( ELEUTHERINE SUBAPHYLLA

GAGNEP ) ..................................................................................................................7

1.2.1. Phân loại khoa học ...........................................................................7

1.2.2. Mô tả cây...........................................................................................8

1.2.3. Phân bố, thu hái và chế biến.............................................................8

1.2.4. Thành phần hóa học..........................................................................9

1.2.5. Tác dụng dược lý...............................................................................9

1.2.6. Công dụng.......................................................................................10

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG N ỚC.........10

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................10

1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ...................................................12

1.4. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NG ỜI......13

1.4.1. Staphylococcus aureus....................................................................13

1.4.2. Escherichia coli ..............................................................................14

1.4.3. Salmonella typhi..............................................................................15

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH

SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO viii

1.4.4. Pseudomonas aeruginosa ...............................................................15

1.5. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH TRÊN NG ỜI...........16

1.5.1. Dermatophytes................................................................................16

1.5.2. Chi Trichophyton ............................................................................17

1.5.3. Chi Microsporum............................................................................18

1.5.4. Chi Epidermophyton .......................................................................19

1.6. KHÁI QUÁT VỀ PH NG PHÁP CHIẾT CAO D ỢC LIỆU.................19

1.6.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation)...........................................20

1.6.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)..........................................20

1.6.3. Kỹ thuật chiết Sohxlet .....................................................................21

1.6.4. Cô đặc và sấy khô ...........................................................................22

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................23

2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU..............................................24

2.2. VẬT LIỆU....................................................................................................24

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................24

2.2.2. Thiết bị, dụng cụ, môi trường .........................................................24

2.3. PH NG PHÁP THÍ NGHIỆM .................................................................25

2.3.1. Bố trí thí nghiệm .............................................................................25

2.3.2. Phương pháp phân lập vi khu n nội sinh .......................................27

2.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng kháng khu n, kháng nấm của vi

khu n nội sinh...................................................................................................28

2.3.4. Phương pháp chiết xuất cao từ củ sâm đại hành............................31

2.3.5. Xác định giới hạn nhiễm khu n của cao chiết................................33

2.3.6. Định tính khả năng kháng khu n, kháng nấm của cao chiết..........34

2.3.7. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khu n

và vi nấm gây bệnh...........................................................................................34

2.4. ĐỊNH DANH VI KHUẨN NỘI SINH BẰNG TEST SINH HÓA...............36

PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.....................................45

3.1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY .............................46

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH

SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO ix

3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÂY SÂM ĐẠI HÀNH

......................................................................................................................46

3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM

GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH...............................................................50

3.3.1. Kết quả định tính khả năng kháng khu n của vi khu n nội sinh....50

3.3.2. Kết quả định tính khả năng kháng nấm của vi khu n nội sinh.......56

3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH SINH HÓA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH....61

3.5. KHẢO SÁT ẢNH H ỞNG CỦA DUNG MÔI CHIẾT ĐẾN KHỐI

L ỢNG CAO CHIẾT THU Đ ỢC TỪ CỦ SÂM ĐẠI HÀNH...............................62

3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết

.........................................................................................................62

3.5.2. Kết quả thử giới hạn nhiễm khu n của cao chiết ...........................64

3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM

CỦA CAO CHIẾT TỪ CỦ SÂM ĐẠI HÀNH..........................................................64

3.6.1. Kết quả định tính khả năng kháng khu n của cao chiết từ củ sâm

đại hành .........................................................................................................64

3.6.2. Kết quả định tính khả năng kháng nấm của cao chiết từ củ sâm đại

hành .........................................................................................................67

3.7. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO

CHIẾT ......................................................................................................................70

3.8. THẢO LUẬN...............................................................................................76

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................78

4.1. KẾT LUẬN..................................................................................................79

4.2. ĐỀ NGHỊ......................................................................................................80

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................81

PHỤ LỤC.................................................................................................................88

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH

SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH

SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 2

Vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria) được tìm thấy trong hầu hết

các loài thực vật, chúng cư trú ở trong mô của thực vật và giữa chúng hình thành

một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng,

hội sinh (Compant và cs., 2005) Hầu hết các dạng nội sinh này bắt đầu xuất hiện ở

vùng rễ hay lá, một số loại có thể nội sinh trên hạt Nhiều vi khuẩn nội sinh thúc đẩy

thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân kiểm soát sinh

học (Hardoim và cs., 2008) Vi khuẩn nội sinh sản xuất các sản phẩm tự nhiên có

lợi cho thực vật mà ta có thể khai thác những tác nhân đó để ứng dụng trong y học,

nông nghiệp hay công nghiệp (Menparavà cs , 2013) Đã có nhiều nghiên cứu về

ứng dụng của vi khuẩn nội sinh như nghiên cứu của Arunachalam và cộng sự

(2010) đã chứng minh rằng dịch nuôi cấy vi khuẩn nội sinh phân lập từ lá cây thuốc

Andrographis paniculata cho thấy khả năng kháng cả vi khuẩn Gram dương và

Gram âm (6 vi khuẩn gây bệnh cho người và 2 vi khuẩn gây bệnh cho cá) Kim J.

W. (2000) đã tách chất ức chế β-lactamase từ vi khuẩn sống trong mô thực vật Tác

giả đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô của 25 loài thực vật khác

nhau và phân lập được 600 chủng vi khuẩn Trong đó đã tìm ra được 10 chủng có

hiệu lực cao và có khả năng chống lại hoạt động của nấm Candida albicans. Sunkar

và cộng sự (2013) đã phân lập và xác định được vi khuẩn nội sinh Brassica

oleracea có khả năng sinh các enzym amylase, protease, cellulase có tiềm năng

trong sản xuất enzym với quy mô lớn, đồng thời cho thấy hoạt động kháng khuẩn

đối với Klebsiella pneumoniae (20 mm), Staphylococcus aureus (25 mm).

Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một dược liệu phổ biến ở

nước ta Các công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của sâm đại hành cho thấy

loài cây này có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, làm giảm khối u, trị phỏng

Dịch chiết toàn phần của củ cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep) có

tác dụng ức chế rõ rệt in vitro đối với phế cầu khuẩn, liên cầu tan máu, tụ cầu vàng,

tác dụng yếu với Shigella flexneri, Bacillus anthracis, B. mycoides (Lê Thị Hồng

Vân và cs , 2008) Chiết xuất dichloromethane từ củ của Eleutherine bulbosa

(Miller) cho thấy hoạt động kháng nấm Cladosporium sphaerospermum mạnh