Giáo trình CN nuôi cấy mô tế bào thực vật - Chương 3 docx

102

Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Chương 3.THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY PHÔI IN VITRO

3.1.Phôi soma

Được hình thành không thông qua quá trình tạo mô sẹo được gọi là phôi vô tính,

tế bào phôi vô tính có thể được tạo ra trực tiếp và nhân sinh khối bằng hệ thống nuôi cấy

thích hợp. Những tế bào phôi vô tính này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc

được dùng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo với lớp bao alginate. Phôi vô

tính được xem như kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả cao trong nhân giống cây trồng.

3.1.1. Sự phát sinh phôi soma

Những tế bào trong phôi hợp tử biểu hiện được gen cần thiết cho chương trình

phát triển phôi. Giai đoạn trước khi hình thành tế bào phôi soma được gọi là tế bào tiền

phôi. Tế bào tiền phôi phân chia để hệ thống tế bào phôi trực tiếp gọi là sự phát sinh tế

bào phôi trực tiếp.

Có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần chất kích thích st , có nhiều tế

bào cần Auxin để tiến hành phân bào trước khi phát sinh tế bào phôi. Có nhiều tế bào

hình thành phôi từ mô sẹo, trong trường hợp này sự phát sinh phôi soma được tiến hành

gián tiếp.

Hai danh từ tế bào tiền phôi PEDC ( Preembryogenic determined cell) và tế bào

phát sinh phôi IEDC ( induced embryogenic determined cell) dùng để phân loại mô,

nhưng thực chất là 1 quá trình tiếp nối nhau, kết thúc sự phát triển là sự hệ thống những

tế bào phôi (EC- Embryogenic cell).

Những tế bào ở những mô có quan hệ với sự sinh sản như hạt phấn, chồi mầm có

khả năng hệ thống tế bào phôi dễ dàng hơn những tế bào ở những mô trưởng thành. Khi

mô có chứa tế bào phôi, kích thích sự phân chia tế bào trong giai đoạn này là cần thiết để

duy trì tình trạng phôi và hình thành tế bào phôi soma.

Tế bào sinh phôi có thể hệ thống ở những tế bào bình thường được nuôi cấy trên

môi trường có auxin và có thể không có cytokinin. Lượng cytokinin có trong tế bào cao

thường phát sinh phôi thấp. Khi một tế bào phôi được thu nhận, sự có mặt của auxin sẽ

gây tổn hại đến sự pt bt của phôi. Những nhân tố khác ah đến sự pt của phôi như tỉ lệ đạm

amonium và nitrate trong môi trường và pH thấp .. Hay sự lặp đi lặp lại chu kì phát sinh

phôi có thể bị phá vỡ do sự giảm hay bỏ hẳn auxin ra khỏi môi trường.

103

Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Sự hình thành phôi thông qua 2 con đưòng PEDC và IEDC. Con đường PEDC là

con đường phát sinh phôi không qua quá trình tạo mô sẹo và IDEC là con đường thông

qua quá trình tạo mô sẹo.

Có 2 bước dẫn đến sự hệ thống phôi:

1. Sự biệt hoá của tế bào có khả năng phát sinh phôi

2. Sự phát triển của những tế bào phôi mới hệ thống.

Như vậy có hai môi trường cần thiết cho nuôi cấy phôi:

1. Môi trường cần cho sự phát sinh tế bào phôi

2. Môi trường cần cho sự phát triển những tế bào này thành những tế bào có khả

năng phát sinh phôi.

Bước 1 cần có mặt auxin và bước 2 phải giảm thấp hay không có mặt của auxin.

Có hai yếu tố quan trọng trong phát sinh phôi: Auxin và nitrogen.

Phát sinh phôi soma là kiểu mẫu của tính toàn thế, có thể khảo sát toàn bộ tiến

trình biệt hoá của tế bào cũng như cơ chế thể hiện tính toàn năng của tế bào thực vật.

3.1.2. Thiết lập hệ thống phát sinh phôi đồng nhất và hiệu suất cao

Một hệ thống thích hợp đã được thiết lập cho mục đích nghiên cứu trên qua việc

dùng tế bào dung dịch huyền phù cà rốt. Những cụm tế bào phôi được chọn lọc sau khi

lọc qua lưới để loại bỏ những cụm tế bào to và được ly tâm trong dung dịch Ficoll và

được cấy chuyển sang môi trường không có auxin và có zeatin (10-7M). Phát sinh phôi

đồng nhất xảy ra từ những cụm tế bào có tần suất khoảng 90% phát sinh phôi. Hệ thống

này cho thấy thích hợp để nghiên cứu tiến trình phát sinh phôi từ những cụm tế bào có

khả năng phát sinh phôi, được gọi là những cụm tế bào giai đoạn 1. Tuy nhiên từ những

cụm tế bào này có thể biệt hoá tạo phôi trong môi trường có auxin và không có chất nào

khác, phát sinh phôi có thể ghi nhận được thông qua xác định những cụm tế bào có khả

năng phát sinh phôi ở giai đoạn 1. Như vậy tiến trình hình thành những cụm tế bào giai

đoạn 1 từ những tế bào đơn rất quan trọng để phân tích tiến trình phát sinh phôi. Một hệ

thống được yêu cầu là có tần suất phát sinh phôi cao từ những tế bào đơn.

Những tế bào đơn có kích thước nhỏ, tròn và tế bào chất đậm đặc được gọi là

những tế bào giai đoạn 0, thu nhận được qua lọc, rây. Những tế bào giai đoạn 0 được nuôi

cấy trên môi trường có 2,4 D (5.10-8M) trong 6 ngày và được chuyển sang môi trường

không có auxin, tế bào phôi hình thành với tần suất cao. Xử lí tế bào trước với auxin cho

thấy là cần thiết và zeatin (10-6M), Manitol (10-3 M) và 02 cao (40%) có tác dụng thúc

đẩy phát sinh phôi. Hệ thống này là một hệ thống có hiệu quả cho phép nghiên cứu tiến

trình phát sinh phôi soma từ những tế bào đơn. Những tế bào giai đoạn 0 được nuôi cấy

trên môi trường không có auxin cho thấy mất khả năng thể hiện tính toàn thế, trong khi