Giáo trình CN nuôi cấy mô tế bào thực vật - Chương 2 pptx

42

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật http://www.ebook.edu.vn

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận

nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần

môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy.

2.6.1. Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số

thành phần cơ bản sau:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Các vitamin

- Các amino axít

- Nguồn các- bon: một số các loại đường

- Các chất điều hoà sinh trưởng

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây,

bột chuối khô...

- Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar)

Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh

trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro.

Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn

môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:

- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành

phần môi trường.

- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo

phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân

giống…)

- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…).

2.6.1.1. Các chất khoáng

Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng. Ví dụ, Mg là một

phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng

của amino axít, vitamin, protein và các axít nucleic. Tương tự, Fe, Zn và Mo cũng là

thành phần của một số enzym.

Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần chất khoáng khác nhau, ví

dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá nghèo nàn,

nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5.

43

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật http://www.ebook.edu.vn

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô và

tế bào thực vật:

- Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P....) cho sự tổng hợp các chất hữu cơ.

Nitơ, lưu huỳnh, phốt-pho là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các

axít nucleic và nhiều chất hữu cơ khác. Canxi và axít boric được tìm thấy chủ yếu ở thành

tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định màng sinh học.

- Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều enzym (là các co￾factor): Magie, kẽm, sắt... và nhiều nguyên tố vi lượng là những phần quan trọng của các

enzym.

- Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu

của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật. Ví dụ, K và C rất quan trọng

trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều

enzym.

Trong môi trường, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và đa

lượng:

- Các chất dinh dưỡng đa lượng bao gồm sáu nguyên tố: nitrogen (N), phosphorus

(P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn tại dưới dạng muối

khoáng, là thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau. Tất cả các nguyên tố

này là rất cần thiết cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật. Môi trường nuôi cấy phải

chứa ít nhất 25 mmol/L nitrate và potassium. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều cho

thấy nguồn N cung cấp trong môi trường dưới cả 2 dạng nitrate và amonium (2-20

mmol/L) là tốt hơn cả. Trong trường hợp chỉ dùng amonium, thì cần phải bổ sung thêm

một acid dạng mạch vòng (cycle acids), tricarboxylic acid hoặc một số acid khác nữa

(dạng muối), như: citrate, succinate, hoặc malate sao cho mọi ảnh hưởng độc do nồng độ

của amonium vượt quá 8 mmol/L trong môi trường được giảm bớt. Khi các ion nitrate và

amonium cùng hiện diện trong môi trường nuôi cấy, thì ion sau được sử dụng nhanh hơn.

Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1-3

mmol/L.

2.6.1.2. Các nguyên tố đa lượng

a. Nguồn carbon (C)

Đường sucrose (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường

xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi xanh

có khả năng quang hợp. Khi khử trùng, đường sucrose bị thuỷ phân một phần, thuận lợi

hơn cho cây hấp thụ. Trong một số trường hợp, ví dụ nuôi cấy mô cây một lá mầm,

đường glucose tỏ ra tốt hơn so với sucrose. Mô thực vật có khả năng hấp thu một số

44

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật http://www.ebook.edu.vn

đường khác như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm chí tinh bột, nhưng các loại

đường này hầu như rất ít được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật.

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng,

mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân

tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn

carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là

sucrose, nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích

nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến

12% (cảm ứng stress nước).

Tiếp đến là glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy và cho hiệu

quả tương đương sucrose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast), còn fructose

cho hiệu quả kém hơn. Sucrose, trong khi khử trùng môi trường, bị biến đổi thành

glucose và fructose. Trong tiến trình này, đầu tiên glucose sẽ được sử dụng và sau đó là

fructose. Các carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose,

melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được

dùng trong những trường hợp đặc biệt.

Các dạng polysaccharide như tinh bột, pectine, dextrine cũng có thể dùng cho

nuôi cấy, tuy nhiên những loại tế bào được nuôi trên môi trường có chứa một trong các

polysaccharide trên nhất định phải thể hiện khả năng thủy phân thông qua các enzyme

chẳng hạn như amylase. Có những chủng tế bào nuôi cấy giải phóng ra môi trường chứa

tinh bột khá nhiều amylase. Chuyển chúng lên môi trường chỉ chứa sucrose lượng

amylase thải ra sẽ giảm ngay.

Glycerin cũng có thể được tế bào sử dụng. Mannitol hoặc sorbitol hoàn toàn trung

tính vì không thâm nhập vào bên trong tế bào, nhưng chúng được sử dụng rộng rãi trong

nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast với chức năng là chất ổn định áp suất thẩm

thấu, hoặc tương tự sucrose chúng cũng được dùng để cảm ứng stress nước. Các loại

rượu như ethanol, methanol ít hiệu quả, còn propanol và butanol thì rất độc.

Acid hữu cơ thường không phải là nguồn carbon thích hợp cho tế bào nuôi cấy.

Thí nghiệm với các acid: folic, succinic, pyruvic và keto-glutaric chỉ đạt 15% sinh trưởng

so với sucrose.

Các mô và tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy ít có khả năng tự dưỡng và

vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng. Thậm chí

các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dưới các điều kiện đặc biệt trong suốt

quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡng carbon. Việc bổ sung nguồn carbon bên ngoài vào

môi trường làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các chồi xanh.

45

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật http://www.ebook.edu.vn

Sự thủy phân từng phần sucrose xuất hiện khi môi trường được khử trùng. Các tế

bào và mô nuôi cấy đã sinh trưởng trên môi trường có sucrose được khử trùng bằng

autoclave tốt hơn trên môi trường có sucrose được khử trùng bằng màng lọc (filter). Điều

này cho thấy các tế bào thích hợp với nguồn dự trữ có sẵn của glucose và fructose do

thủy phân sucrose khi khử trùng bằng autoclave. Sử dụng fructose được khử trùng bằng

autoclave không được đề cập đến vì nó có thể gây bất lợi cho sinh trưởng của mô.

b. Nitơ (N):

Thành phần chính của hầu hết các môi trường là nitơ vô cơ dưới dạng nitrat (NO3

-

) hoặc amonium (NH4

+

). Các muối được dùng phổ biến là kali nitrat (KNO3

), nitrat amon

(NH4

NO3

) và canxi nitrat (Ca(NO3

)

2

.4H2

O). Những hợp chất này cung cấp nitơ vô cơ

cho thực vật để tổng hợp các phân tử chất hữu cơ phức tạp.

Mô , tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như

aminonium và nitrate, đồng thời cũng sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino acid.

Tỉ lệ amonium và nitrate thay đổi tùy theo loài và trạng thái phát triển của mô.

Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc

NH4NO3. Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3. Trong một số ít

trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea. Tổng nồng độ của NO3

+

và NH4

+

trong môi

trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục đích nghiên cứu.

Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ. Nitrat có thể được

vận chuyển theo mạch xylem đến các bộ phận của cây, tại đó nó sẽ tham gia vào quá

trình đồng hoá nitơ. Nitrat có thể được dự trữ ở không bào và thực hiện chức năng quan

trọng trong việc điều chỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây trồng.

Sự biến đổi nitrat: Nitrat không thể sử dụng ngay lập tức để sinh tổng hợp các

chất hữu cơ phức tạp mà trước tiên cần phải được khử thành amoniac. Phản ứng diễn ra

như sau:

NO3

-

+ 8H

+

+ 8e-

→ NH

3

+ 2 H

2

O + OH￾Phản ứng này được thực hiện qua 2 bước nhờ hai enzym: nitrat- và nitrit

reductaza. Trước tiên, nitrat được biến đổi thành nitrit nhờ nitrat reductaza. Tiếp theo,

nitrit bị khử thành amoniac nhờ enzym nitrit reductaza. Sự biến đổi của nitrat thành nitrit

diễn ra trong tế bào chất. Trong hầu hết các cây trồng, sự khử nitrat có thể diễn ra ở cả lá

và đỉnh chồi. Sự khử nitrat diễn ra ở mức độ nào phụ thuộc rất lớn vào các nhân tố như:

46

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật http://www.ebook.edu.vn

loài, tuổi cây, nồng độ nitrat. Cụ thể, các loài cây thân gỗ có khả năng khử nitrat rất cao.

Khi nồng độ nitrat thấp, sự khử hầu như diễn ra ở rễ. Ngược lại, nếu nồng độ nitrat cao

thì quá trình này diễn ra cả ở lá. Các cation kết hợp với nitrat có vai trò quan trọng trong

việc hấp thu nitrat. Nếu cation là K

+

thì hoạt động của enzym nitrat reductaza ở rễ thấp và

nitrat sẽ được vận chuyển lên các đỉnh chồi của cây. Trong trường hợp cation là Ca

2+

thì

sự khử ở rễ lại diễn ra mạnh hơn.

Sự khử nitrit thành NH

3

nhờ enzym nitrit reductaza diễn ra trong lá cây, trong đó

điện tử cần thiết cho phản ứng này được cung cấp từ sự khử các hợp chất sắt trong hệ

thống quang hợp.

Sự khử nitơ chứa trong các hợp chất: Amonium và amoniac là những chất độc

đối với thực vật ngay ở nồng độ thấp. Do đó chúng cần được chuyển hoá thật nhanh

thành các hợp chất phân tử lượng nhỏ có chứa N như: asparagin, arginin, allantoin và

betain. Sinh tổng hợp glutamin và glutamat diễn ra cả ở rễ và đỉnh chồi là các quá trình

cơ bản trong sự chuyển hoá amonium.

Bên cạnh sự khử độc tính của amonium và amoniac, các hợp chất chứa nitơ phân

tử lượng thấp còn có một số chức năng khác. Chức năng quan trọng nhất là cung cấp N

trong các liên kết hữu cơ và -NH2 được thực vật hấp thụ như nguồn N hữu cơ cho quá

trình sinh tổng hợp các amino axít và protein. Các hợp chất phân tử lượng nhỏ này còn

được sử dụng làm chất mang cation như Mn, Cu để vận chuyển các cation qua hệ thống

mạch dẫn trong cây. Ngoài ra, chúng còn như một kho dự trữ nitơ dư thừa. Ngược lại với

con người và động vật, thực vật không thể bài tiết các hợp chất nitơ hữu cơ như urê

nhưng nhờ cơ chế này đã cho phép thực vật dự trữ được nitơ hữu cơ.

c. Phospho (P):

Photpho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật . Nó tham gia vào việc vận

chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng.

Trong môi trường nuôi cấy, Photpho được cung cấp dưới dạng mono hay

dihydrogenphosphate potasium hay sodium. Ion photphate hóa trị 1 và 2 có thể chuyển

đổi lẫn nhau tùy theo pH. Ion H2PO4

-

chiếm ưu thế ở pH nhỏ hơn 7, đây là đặc tính của

hầu hết môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật cũng là ion dễ được thực vật hấp thụ

nhất. Photpho thường được cung cấp dưới dạng photphate hòa tan hạn chế.

Nồng độ photphate hòa tan cao trong môi trường sẽ làm giảm sự tăng trưởng của

mô, có thể do calcium và một số nguyên tố vi lượng bị kết tủa trong môi trường hoặc bị

giảm hấp thu vào trong mô. Nồng độ ion photphate cho vào môi trường cao nhất là 18,9

mM, trung bình là 1,7 mM, hầu hết các môi trường chứa photphate khoảng 1.3 mM.