Xác định các Microrna tuần hoàn liên quan đến thoái hóa khớp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

HỒ THỊ BÍCH PHƯỢNG

XÁC ĐỊNH CÁC MICRORNA TUẦN HOÀN

LIÊN QUAN ĐẾN THOÁI HÓA KHỚP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

HỒ THỊ BÍCH PHƯỢNG

XÁC ĐỊNH CÁC MICRORNA TUẦN HOÀN

LIÊN QUAN ĐẾN THOÁI HÓA KHỚP

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn 1 : TS. LÊ THỊ TRÚC LINH

Giảng viên hướng dẫn 2 : PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Hồ Thị Bích Phượng

Ngày sinh: 18/03/1990 Nơi sinh: Bình Định

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên : 1884202010004

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho

Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở

Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống

thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Hồ Thị Bích Phượng

Scanned by TapScanner

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Xác định các microRNA tuần hoàn liên quan đến

thoái hóa khớp” là bài nghiên cứu của chính tôi.

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam đoan

rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố hoặc được

sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác.

Không có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn

này mà không được trích dẫn theo đúng quy định.

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các trường

đại học hoặc cơ sở đào tạo khác.

TP. Hồ Chí Minh, năm 2021

Hồ Thị Bích Phượng

ii

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành tốt luận văn này, lời cảm ơn đầu tiên xin cho em được gửi

đến hai giảng viên hướng dẫn trực tiếp là TS. Lê Thị Trúc Linh và PGS.TS. Lê Huyền

Ái Thúy. Cảm ơn hai Cô đã luôn định hướng, dẫn dắt và giúp đỡ cho em trong suốt thời

gian thực hiện đề tài.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy/cô trong Khoa Công nghệ sinh học và

Khoa Sau đại học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy, truyền đạt

kiến thức và hỗ trợ em thực hiện được đề tài. Cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Mở

Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được học tập, thực hiện và hoàn thành

luận văn này.

Cảm ơn tất cả các bạn trong nhóm nghiên cứu, các bạn trong phòng Y Dược￾trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM cũng như các bạn trong lớp cao học MBIO018

đã ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn nồng nhiệt nhất đến gia đình tôi. Mọi người

chính là nguồn động viên tinh thần tích cực, luôn bên cạnh ủng hộ và cổ vũ cho tôi.

Xin Chân Thành Cảm Ơn!

iii

TÓM TẮT

Thoái hóa khớp (THK) là dạng viêm khớp phổ biến nhất và là một trong những

nguyên nhân chính gây ra các cơn đau ở khớp, làm giảm khả năng vận động và có thể

dẫn đến tàn phế ở người. Chẩn đoán sớm THK là yếu tố quan trọng giúp cho việc điều

trị bệnh hiệu quả. Tuy nhiên, các phương pháp chẩn đoán hiện nay không đủ nhạy để

phát hiện các thay đổi trong giai đoạn sớm của bệnh. Vì vậy, việc tìm ra các dấu chứng

sinh học (biomarker) có thể giúp phát hiện THK ở giai đoạn đầu cũng như theo dõi tiến

triển của bệnh là rất cần thiết.

Nhiều nghiên cứu cho thấy, các microRNA tuần hoàn (circulating miRNA) lưu

thông trong máu là chỉ thị sinh học tiềm năng giúp chẩn đoán sớm THK trong lâm sàng

nhờ các ưu điểm: không bị phân hủy bởi RNase, chịu được điều kiện khắc nghiệt (nhiệt

độ cao, pH rất thấp hoặc rất cao), lưu trữ trong thời gian dài, chịu được việc đông lạnh￾rã đông nhiều lần và lấy mẫu không cần phương pháp xâm lấn. Tuy nhiên, số liệu của

các nghiên cứu không có tính lặp lại. Nghiên cứu này thực hiện giải trình tự tất cả các

miRNA có trong mẫu máu (cụ thể là huyết tương) của người bị THK so với người bình

thường bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS).

Kết quả giải trình tự xác định được 206 miRNA có biểu hiện bất thường giữa người

THK so với người bình thường. Trong đó, có 15 miRNA thay đổi biểu hiện trong THK

có ý nghĩa thống kê được ghi nhận, gồm 10 miRNA tăng và 5 miRNA giảm. Thực hiện

realtime PCR trên số mẫu lớn hơn với 4 miRNA trong số 15 miRNA để kiểm tra kết quả

NGS. Kết quả miR-146b-5p tăng biểu hiện, còn miR-140-3p và miR-199b-3p giảm biểu

hiện, tương đồng với kết quả NGS trước đó. Tuy nhiên, kết quả realtime PCR của miR￾26a-5p lại không có sự thay đổi biểu hiện giữa mẫu THK và mẫu bình thường như kết

quả NGS. Cần thực hiện realtime PCR trên số mẫu lớn hơn và kiểm tra tất cả 15 miRNA.

Với phương pháp NGS, dữ liệu đầu ra của nghiên cứu rất lớn, giúp cung cấp bộ số

liệu về các miRNA đặc trưng cho THK một cách có hệ thống, là cơ sở cho các nghiên

iv

cứu thực nghiệm tiếp theo ở Việt Nam, nhằm tìm ra các miRNA có thể làm chỉ thị phân

tử giúp chẩn đoán sớm bệnh.

v

SUMMARY

Osteoarthritis (OA) is the most common form of arthritis and is one of the main

causes of pain in the joints, reduces mobility, and can lead to disability in humans. Early

diagnosis of OA is an important factor for effective treatment. However, current

diagnostic methods are not sensitive enough to detect changes in the early stages of OA.

Therefore, it is essential to find out biomarkers that can use to detect OA in the early

stages as well as monitor the progression of the disease.

Many studies show that circulating miRNAs are potential biomarkers for early

diagnosis of OA in the clinic due to the advantages: not degraded by RNase, tolerant to

extreme conditions (high temperature, very low or very high pH), long term storage,

repeated freeze-thaw cycles and non-invasive sampling. However, data between studies

are not repeatable. This study aimed to identify miRNAs changed expression in OA

plasma sample in Vietnam.

Next generation sequencing identified 206 miRNAs with abnormal expression

between OA patients and controls. Of which, the expression of 15 miRNAs significantly

changed in OA compared with control, including 10 increased miRNAs and 5 decreased

miRNAs. Realtime PCR was performed on larger samples for 4 miRNAs out of 15

miRNAs to check NGS result. Similar trend was observed for miR-146b-5p, miR-140-

3p, and miR-199b-3p in which miR-146b-5p increased, whilst miR-140-3p and miR￾199b-3p decreased expression in OA. However, miR-26a-5p expression is not change.

This study provide systematically data regarding miRNAs changed expression in

OA. Data from this study would be useful for future studies for identifying miRNAs

utilized as molecular markers for early diagnosis of OA.

vi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ ii

TÓM TẮT..................................................................................................................... iii

SUMMARY ....................................................................................................................v

MỤC LỤC......................................................................................................................vi

DANH MỤC HÌNH.......................................................................................................ix

DANH MỤC BẢNG.......................................................................................................x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................xi

Chương 1. GIỚI THIỆU................................................................................................1

1.1. Cơ sở hình thành luận văn..................................................................................2

1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................3

1.3. Câu hỏi nghiên cứu..............................................................................................3

1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................4

1.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................4

1.6. Ý nghĩa nghiên cứu..............................................................................................4

Chương 2. CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU......................................................5

2.1. Tổng quan về thoái hóa khớp (osteoarthritis)...................................................6

2.1.1. Thoái hóa khớp là gì? ......................................................................................6

2.1.2. Tỷ lệ bệnh thoái hóa khớp...............................................................................6

2.1.3. Các giai đoạn thoái hóa khớp ..........................................................................7

2.1.4. Triệu chứng bệnh thoái hóa khớp....................................................................8

2.1.5. Các nguyên nhân và yếu tố nguy cơ gây bệnh thoái hóa khớp.......................9

2.1.6. Các con đường tín hiệu liên quan đến thoái hóa khớp..................................11

2.1.7. Các phương pháp chẩn đoán bệnh thoái hóa khớp........................................12

2.1.8. Các phương pháp điều trị thoái hóa khớp .....................................................13

2.2. Tổng quan về microRNA ..................................................................................16

vii

2.2.1. MicroRNA là gì? ...........................................................................................16

2.2.2. Quá trình sinh tổng hợp (biogenesis) của microRNA...................................17

2.2.3. Nhận diện gen mục tiêu.................................................................................21

2.2.4. Cơ chế điều hòa biểu hiện gen của miRNA..................................................22

2.2.5. Vai trò của miRNA........................................................................................23

2.2.6. Sự biểu hiện và vai trò của microRNA trong thoái hóa khớp.......................23

2.3. Tổng quan về microRNA tuần hoàn................................................................27

2.3.1. MicroRNA tuần hoàn là dấu chứng sinh tiềm năng cho chẩn đoán THK ....27

2.3.2. Các phương pháp phát hiện miRNA tuần hoàn ............................................28

2.3.3. Tình hình nghiên cứu về microRNA tuần hoàn trong bệnh thoái hóa khớp.29

2.4. Tổng quan về Next Generation Sequencing ....................................................32

2.4.1. Next Generation Sequencing là gì?...............................................................32

2.4.2. Nguyên tắc của kỹ thuật NGS (Krishna et al., 2019)....................................33

2.4.3. Ưu điểm của NGS .........................................................................................43

2.4.4. Ứng dụng hiện nay của NGS.........................................................................44

2.4.5. Hạn chế của NGS ..........................................................................................45

2.5. Tổng quan về RT-qPCR....................................................................................45

2.5.1. RT-qPCR là gì? .............................................................................................45

2.5.2. Nguyên tắc phản ứng RT-qPCR....................................................................45

Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................49

3.1. Vật liệu, thiết bị và dụng cụ..............................................................................50

3.1.1. Vật liệu ..........................................................................................................50

3.1.2. Thiết bị, hóa chất và dụng cụ ........................................................................50

3.1.3. Thời gian thực hiện và địa điểm thí nghiệm .................................................53

3.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................53

3.2.1. Thu nhận mẫu máu người bệnh THK và người bình thường........................53

3.2.2. Tách chiết RNA từ huyết tương ....................................................................54

3.2.3. Tối ưu hóa quy trình bảo quản mẫu RNA bằng RNAstable .........................56

3.2.4. Thực hiện giải trình tự NGS..........................................................................56

viii

3.2.5. RT-qPCR hai bước ........................................................................................57

Chương 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................60

4.1. Thu nhận mẫu máu ...........................................................................................61

4.2. Tối ưu hóa quy trình tách chiết RNA từ huyết tương....................................61

4.3. Tách chiết RNA cho tất cả mẫu máu thu được...............................................66

4.4. Tối ưu hóa quy trình bảo quản mẫu RNA bằng RNAstable .........................69

4.5. Giải trình tự NGS và phân tích kết quả ..........................................................70

4.5.1. Kiểm tra mẫu trước khi gửi làm NGS...........................................................70

4.5.2. Phân tích kết quả NGS tìm ra các miRNA biểu hiện bất thường ở mẫu THK

so với mẫu bình thường...........................................................................................71

4.6. Kiểm tra kết quả NGS bằng realtime PCR.....................................................78

4.6.1. Kiểm tra lại trên 6 mẫu gửi giải trình tự........................................................78

4.6.2. Kiểm tra trên tất cả các mẫu máu đã thu nhận ..............................................79

4.8. Thảo luận............................................................................................................80

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................83

5.1. Kết luận...............................................................................................................84

5.2. Kiến nghị.............................................................................................................84

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................85

PHỤ LỤC 1...................................................................................................................96

PHỤ LỤC 2...................................................................................................................97

PHỤ LỤC 3...................................................................................................................98

PHỤ LỤC 4.................................................................................................................107

ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Hình chụp X-quang minh họa các giai đoạn của THK....................................7

Hình 2.2. Vị trí của miRNA trong DNA bộ gen............................................................18

Hình 2.3. Quá trình trưởng thành của miRNA điển hình...............................................18

Hình 2.4. Quá trình trưởng thành của miRNA không điển hình ...................................20

Hình 2.5. Kỹ thuật NGS Pyrosequencing ......................................................................34

Hình 2.6. Kỹ thuật NGS Illumina sequencing ...............................................................36

Hình 2.7. Cấu tạo và cách đánh dấu huỳnh quang trên 16 loại mẫu dò.........................41

Hình 2.8. Kỹ thuật SOLiD sequencing ..........................................................................42

Hình 2.9. Cách thiết kế mồi tối ưu cho phản ứng RT-qPCR.........................................48

Hình 4.1. Kết quả điện di gel agarose của RNA được tách bằng hai phương pháp Trizol

và Cột .............................................................................................................................62

Hình 4.2. Biểu đồ khuếch đại của miRNA-144-3p và U6 trong mẫu RNA được tách bằng

phương pháp Trizol và Cột ............................................................................................63

Hình 4.3. Biểu đồ đường cong nóng chảy của các sản phẩm realtime PCR của hai miRNA

là miR-144-3p và U6......................................................................................................64

Hình 4.4. Kết quả điện di gel agarose của các sản phẩm realtime PCR........................65

Hình 4.5. Kết quả điện di RNA bảo quản bằng RNAstable trên gel polyacrylamide ...70

Hình 4.6. Kết quả phân tích PCA cho 6 mẫu khảo sát...................................................72

Hình 4.7. Mức độ biểu hiện của 206 miRNA trong huyết tương phát hiện bằng kỹ thuật

NGS................................................................................................................................73

Hình 4.8. Hai nhóm miRNA tăng và giảm biểu hiện trong THK..................................75

Hình 4.9. Biểu đồ Volcano plot thể hiện hàm lượng của các miRNA thay đổi trong các

mẫu giải trình tự .............................................................................................................76

Hình 4.10. Sự biểu hiện của các miRNA có sự thay đổi biểu hiện có ý nghĩa thống kê

trong bệnh THK .............................................................................................................77

Hình 4.11. Kết quả realtime PCR với mồi miR-140-3p và miR-146-5p cho các mẫu giải

trình tự............................................................................................................................78

Hình 4.12. Sự biểu hiện của một số miRNA trong THK...............................................79

x

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các miRNA biểu hiện bất thường ở người bệnh thoái hóa khớp so với người

bình thường ....................................................................................................................24

Bảng 2.2. Các miRNA tuần hoàn biểu hiện bất thường ở người bệnh thoái hóa khớp so

với người bình thường....................................................................................................30

Bảng 2.3. Thông số các platform của Illumina/Solexa ..................................................38

Bảng 3.1. Tiêu chí lấy mẫu bệnh phẩm..........................................................................53

Bảng 3.2. Các thông số của phản ứng giải trình tự NGS...............................................57

Bảng 3.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA..........................................................58

Bảng 3.4. Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA ....................................................58

Bảng 3.5. Thành phần phản ứng Taqman realtime PCR ...............................................59

Bảng 3.6. Chu trình nhiệt phản ứng Taqman realtime PCR ..........................................59

Bảng 4.1. Nồng độ và độ tinh sạch của RNA sau tách chiết bằng hai phương Trizol và

Cột..................................................................................................................................61

Bảng 4.2. Giá trị chu kỳ ngưỡng của miRNA-144-3p và U6 trong mẫu RNA được tách

chiết bằng hai phương pháp Trizol và Cột.....................................................................63

Bảng 4.3. Nồng độ và độ tinh sạch các mẫu RNA tách chiết từ huyết tương bằng phương

pháp miRNAeasy Serum/Plasma Advanced kit.............................................................66

Bảng 4.4. Kết quả realtime PCR gen 18S mẫu RNA bảo quản bằng RNAstable .........70

Bảng 4.5. Kết quả realtime PCR của 6 mẫu được chọn gửi giải trình tự ......................71

Bảng 4.6. Các miRNA thay đổi biểu hiện trong THK với p-value < 0,1 trong kết quả giải

trình tự............................................................................................................................73

Bảng 4.7. Những miRNA có sự thay đổi biểu hiện có ý nghĩa thống kê trong THK....76