Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc

1

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

--------------------

HỨA THỊ SƠN

Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối

kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum

gây bệnh héo xanh cây lạc

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

2

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

--------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn

đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum

gây bệnh héo xanh cây lạc

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 60 42 40

Học viên: Hứa Thị Sơn

Hƣớng dẫn khoa học: TS. Lê Nhƣ Kiểu

Hà Nội – 2010

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

3

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin cảm ơn phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau

đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ

Việt Nam đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình

học tập.

Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Lê Như Kiểu, Phó viện

trưởng Viện Thổ nhưỡng Nông hóa–Viện Khoa học Nông nghiệp Việt nam,

người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng cho tôi trong suốt thời

gian thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ này.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể bộ môn Vi sinh vật-Viện Thổ nhưỡng

Nông hóa và tập thể bộ môn Sinh học Môi trường Nông nghiệp-Viện Môi

trường Nông nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm

thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm trong công việc để tôi có

thể hoàn thành luận văn đúng thời gian qui định.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia

đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong

suốt thời gian làm luận văn.

Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó./.

Hà nội, ngày 2 tháng 12 năm 2010.

Học viên

Hứa Thị Sơn

4

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A, T, G, C Adenine, Thyamine, Guanine, Cytosine

ADN Acid deoxyribonucleic

ALIV African lampeye iridovirus

BIV bream iridovirus

bp base pair

DGIV Dwarf gourami iridovirus

EBI European Bioinformatics Institute

EDTA Ethylenediamin Disodium Tetra Acetate

EHNV Epizootic haematopoietic necrosis virus

GIV Grouper iridovirus

GSDIV Grouper sleepy disease iridovirus

ISKNV Infectious spleen and kidney necrosis virus

kb kilo base

LCDV Lymphocystis disease virus

MCP Major capsid protein

NCBI National Center for Biotechnology Information

OIE World Organisation for Animal Health

OSGIV orange spotted grouper iridovirus

PCR Polymerase Chain Reaction

RBIV Rock bream iridovirus

RSIVD red sea bream iridoviral disease

SBIV Red sea bream iridovirus

SN-PCR Semi-nested - Polymerase chain reaction

TAE Tris - Acetic – EDTA

TE Tris - EDTA 10 mM

TGIV Taiwan Grouper Iridovirus

5

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1. Tình hình trồng trọt trên thế giới và Việt Nam 2

1.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới 2

1.1.2. Tình hình sản xuất lạc trong nước 3

1.2. Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới và Việt Nam 7

1.2.1. Tình hình bệnh hại lạc trên thế giới 7

1.2.2. Tình hình bệnh hại lạc ở Việt Nam 14

1.3. Khái niệm vềkiểm soát sinh học 16

1.4. Tại sao kiểm soát sinh học lại phổ biến 17

1.5. Những vấn đề trong kiểm soát sinh học 18

1.6. Cơ chế đối kháng 19

1.6.1.Cơ chế kháng sinh 19

1.6.2.Những hợp chất dễ bay hơi và enzim 21

1.6.3.Sự cạnh tranh 22

1.6.4.Sự kí sinh 23

1.6.5.Sự giảm độc tính 23

1.6.6.Kháng hệ thống (Sự kích kháng) 24

1.7.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trong và ngoài nước 25

1.7.1.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở ngoài nước 25

1.7.2.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở trong nước 29

CHƢƠNG II.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1.Vật liệu nghiên cứu. 31

2.1.1. Mẫu nghiên cứu 31

2.1.2. Các môi trường phân lập vi khuẩn 31

2.1.3. Thiết bị nghiên cứu 31

2.2. Phương pháp nghiên cứu. 33

2.2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng 33

2.2.2. Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp đục lỗ thạch 34

2.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp cấy chấm điểm 35

2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng 36

2.2.5. Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen

mã hóa phần tử 16S ARN riboxom 39

6

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.2.5.1. Phương pháp PCR thông thường (đơn) 39

2.2.5.2. Phương pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ 40

2.2.5.3 Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR 41

2.2.5.4 Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 43

a. Phương pháp tách dòng 43

b. Phương pháp giải trình tự gen 46

2.2.5.5 Phương pháp tin sinh học (sử dụng phần mềm NCBI, EBI, Expasy…) 46

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1. Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng 47

3.2. Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn 50

3.3. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng 52

3.4. Một số đặc điểm cơ bản của các chủng vi khuẩn đối kháng 54

3.4.1.Một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối kháng 54

3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng đến quá trình nảy

của lạc 57

3.4.3. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do R. solanacearum của các

chủng vi khuẩn đối kháng 58

3.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng lên quá trình sinh

trưởng và phát triển của lạc 61

3.5. Xác định vi trí phân loại các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phương pháp

giải trình tự đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom 63

CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN 75

CHƢƠNG V. KIẾN NGHỊ 76

CHƢƠNG VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

7

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 47

phân lập được

Bảng 3.2 Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng vi khuẩn 50

gây bệnh héo xanh R. Solanacearum

Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh học của 8 chủng vi khuẩn đối kháng 52

Bảng 3.4 Một số đặc điểm sinh học cơ của các chủng vi khuẩn đối kháng 55

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của 8 chủng vi khuẩn đối kháng lên khả năng nảy mầm 57

của hạt lạc

Bảng 3.6 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do R. solanacearum của các 58

chủng vi khuẩn đối kháng trên lạc trong điều kiện nhà kính

Bảng 3.7 Các chỉ tiêu sinh trưởng của lạc khi có bổ sung 61

vi khuẩn đối kháng

Bảng 3.8 Kết quả so sánh trình tự đoạn 16S ARN riboxom chủng TH24 với 71

các chủng vi khuẩn trong ngân hàng gen quốc tế

Bảng 3.9 Kết quả so sánh trình tự đoạn 16S ARN riboxom chủng NA10 với 72

các chủng vi khuẩn trong ngân hàng gen quốc tế

Bảng 3.10 Một số đặc điểm sinh học cơ của các chủng vi khuẩn đối kháng 73

8

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn đối kháng với 51

R. solanacearum BHT gây bệnh héo xanh lạc

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng 53

vi khuẩn đối kháng đại diện

Hình 3.3 Hình thái tế bào chủng vi khuẩn TH24 chụp dưới kính hiển vi 54

điện tử với độ phóng đại 20.000 lần

Hình 3.4 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn của các chủng 60

vi khuẩn đối kháng trên Lạc

Hình 3.5 Điện di đồ ADN tổng số của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu 64

Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 65

Hình 3.7 Tuyển chọn các khuẩn lạc mang gen mã hóa đoạn 16S ARN riboxom 66

của các chủng vi khuẩn NA10 và TH24 bằng phương pháp colony PCR

Hình 3.8 Tách và kiểm tra plasmid mang đoạn gen mã hóa phần tử 16S 67

riboxom của các chủng vi khuẩn đối kháng

Hình 3.9 Kết quả tinh sạch vectơ tái tổ hợp bằng enzim ARNaza 68

Hình 3.10 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom của 70

chủng TH24

Hình 3.11 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom của 70

chủng vi khuẩn NA10

9

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

Bệnh héo xanh cây trồng do khuẩn Ralstonia solanacearum là một bệnh

phổ biến và nghiêm trọng ở nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai tây, lạc, ớt,

gừng... (1, 2, 54,58,57). Đây là bệnh chủ yếu làm giảm năng suất và mất mùa lạc

ở nhiều nước như Trung Quốc, Thái Lan, Việt nam, Indonesia... Hàng năm dịch

bệnh có thể gây thiệt hại từ 50-80% năng suất cây trồng. Tình hình gây hại là

như vậy nhưng cho tới nay những nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc

và vừng chủ yếu chỉ giới hạn trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân

bố của bệnh và bước đầu xác định nguồn gen kháng trong tập đoàn các giống

hiện có.

Kiểm soát dịch bệnh bằng phương pháp sinh học (kiểm soát sinh học)

đang dần trở thành xu hướng phổ biến và được áp dụng rộng rãi trong nông

nghiệp ở nhiều nước trên thế giới. Bằng việc áp dụng các biện pháp sinh học

người ta có thể thay thế các loại thuốc trừ sâu hóa học có hại đến sức khỏe con

người và môi trường sinh thái. Trong đó biện pháp sử dụng vi sinh vật như một

tác nhân kiểm soát và phòng ngừa bệnh hại đang dần trở lên phổ biến (5, 7) vì

hiệu quả rõ rệt mà nó mang lại, các chủng vi sinh vật lựa chọn phải có hoạt tính

đối kháng cao, ổn định trong thời gian dài và không gây hại cho động, thực vật.

Với mục đích này tôi được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài “Tuyển chọn

và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia

solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc”.