Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn cần giờ tp. hồ chí minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SỰ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------------------------

Nguyễn Thị Lan Hương

TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT

KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA MỘT SỐ

CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN

CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT

Mã số: 604240

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS.TRẦN THANH THỦY

Tp.Hồ Chí Minh - 2009

Trang 1

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp

đỡ tôi từ khi thực hiện luận văn tốt nghiệp đến khi thực hiện luận văn thạc sĩ sinh

học. Cô luôn có mặt bên cạnh, giúp đỡ những khi em gặp khó khăn trong suốt quá

trình nghiên cứu, thực hiện luận văn này.

Tôi cũng xin ghi nhớ công ơn PGS.TS. Lương Đức Phẩm đã luôn tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện luận văn.

Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong phòng thí nghiệm Vi sinh –

Sinh hóa, trường Đại học Sư phạm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành

công viêc nghiên cứu thực hiện luận văn này.

Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khóa 17 và 18 ngành Vi

sinh vật học, trường Đại học Sư phạm TpHCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt

quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian qua.

TpHCM, tháng 8 năm 2009.

NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận văn này là trung thực thể hiện qua kết

quả thí nghiệm và chưa ai công bố.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lan Hương

MỞ ĐẦU

RNM Cần giờ là một quần thể TV đa dạng sinh học. Chiến tranh, bom đạn

và các loại chất độc hóa học đã hủy hoại gần như hoàn toàn khu rừng này. Từ năm

1978 đến nay, Thành ủy và UBND Tp.HCM đã phục hồi thành công HST RNM đa

dạng độc đáo này. Đồng thời, cũng từ đó tạo nên một địa điểm lý tưởng phục vụ

cho nghiên cứu khoa học và du lịch sinh thái.

Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là nơi lưu giữ nhiều nguồn gen SV

quý hiếm, bền vững và có khả năng chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt của MT

sống. Trong đó, ĐV và TV đã được nghiên cứu và thống kê rất chi tiết. Riêng hệ

VSV phong phú của RNM Cần Giờ vẫn còn nhiều bí ẩn và chưa được khai thác

đúng mức. Trong số các VSV tại đây thì NS chiếm số lượng rất lớn, giữ vai trò

quan trọng trong tuần hoàn vật chất và năng lượng nhờ có hệ enzym phong phú như

cellulase, protease, amylase,…

Nổi bật nhất cũng như được ứng dụng nhiều nhất trong hệ enzym thủy phân

của NS là amylase. Loại enzym phân giải tinh bột này mang lại vị ngọt cho thiên

nhiên và con người đã được nghiên cứu từ rất lâu, đến nay các nhà khoa học đã biết

khá rõ về nó. Hiện nay amylase là một trong những hệ enzym quan trọng nhất của

ngành công nghệ sinh học vì chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực

khác nhau như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp lên men, công

nghiệp dệt,..Tiếp tực tìm hiểu, khám phá những bí ẩn về cấu trúc và đặc tính của

amylase để nâng cao hiệu suất xúc tác của chúng là đề tài hấp dẫn đối với nhiều nhà

nghiên cứu.

Tuy vậy, nước ta chưa lưu ý nhiều đến lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất các

chế phẩm amylase từ VSV cũng như NS. Việc sản xuất amylase từ NS có rất nhiều

ưu việt như rút ngắn quá trình sản xuất, tận dụng được các nguồn nguyên liệu, phế

phẩm nông nghiệp góp phần giảm ô nhiễm MT, enzym có hoạt tính cao và giảm giá

thành sản phẩm.... so với các enzym có nguồn gốc từ TV và ĐV. Đặc biệt nếu thu

được các chủng NS có khả năng sinh amylase cao và sinh trưởng trong những điều

kiện khắc nghiệt như RNM Cần Giờ sẽ rất có ích vì bổ sung thêm được những

chủng NS có đặc tính quý, đầy tiềm năng và ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn

nuôi. Mặc dù vậy, việc nghiên cứu NS sinh amylase từ RNM hiện vẫn chưa được

khai thác đúng mức.

Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận amylase từ NS, cũng

như mong muốn thu nhận được nguồn amylase mang đặc tính quý, chúng tôi tiến

hành đề tài “Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng

NS từ RNM Cần Giờ Tp.HCM”.

Mục đích của đề tài.

Tuyển chọn được các chủng NS sinh amylase cao từ RNM Cần Giờ.

Nhiệm vụ của đề tài.

- Phân lập các chủng NS thu nhận được từ RNM Cần Giờ.

- Tuyển chọn một số chủng NS có khả năng sinh amylase cao.

- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại đến loài

các NS đã tuyển chọn.

- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tổng hợp

amylase của các chủng NS đã chọn.

- Nghiên cứu một số tính chất của enzym thu được.

- Khảo sát các đặc tính sinh học khác.

- Thu nhận amylase bán tinh khiết và so sánh với enzym thương mại trên thị

trường.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Các chủng NS phân lập từ 5 xã: Long Hòa, Lý Nhơn, An Thới Đông, Tam

Thôn Hiệp và Bình Khánh ở RNM Cần Giờ, Tp.HCM.

- Đề tài được tiến hành nghiên cứu tại PTN Vi sinh – Sinh hóa, khoa Sinh

học, trường Đại học Sư phạm Tp.HCM trong thời gian từ tháng 9 năm 2008

đến tháng 5 năm 2009.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Vài nét khái quát về RNM Cần Giờ .

RNM (Mangrove) là thuật ngữ dùng để chỉ các loài TV hoặc một khu rừng

có nhiều loài sống ở vùng giao thoa giữa đất liền và biển. Chúng có thể mọc tốt ở

những vùng khí hậu nóng ẩm [4].

Theo GS. Phan Nguyên Hồng (1995), diện tích RNM trên thế giới khoảng

16.670.000 ha, và khu vực Châu Á chiếm diện tích lớn nhất trong đó. Theo số liệu

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cho thấy, năm 1943 diện tích RNM Việt

Nam trên 400.000 ha, đến năm 1996 giảm còn 290.000 ha và 279.000 vào năm

2006. Với diện tích này thì RNM Việt Nam cũng chiếm một phần khá lớn trong khu

vực. RNM nguyên sinh tự nhiên hiện nay hầu như không còn. Đa số RNM hiện nay

là rừng trồng (62%) còn lại là rừng thứ sinh nghèo hoặc rừng mới tái sinh trên bãi

bồi. HST RNM phân bố dọc bờ biển Việt Nam thuộc 28 tỉnh và thành phố, tập trung

chủ yếu ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, bán đảo Cà Mau và hai tỉnh phía Bắc

là Nam Định và Thái Bình. Các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long có diện tích RNM

chưa đến 100.000 ha. Riêng RNM Cần Giờ hay rừng Sác, sau những nỗ lực khôi

phục thành công, hiện nay có diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha [74].

Với diện tích đạt được như trên, cùng với độ đa dạng sinh học bậc nhất trong

các RNM ở Đông - Nam Á , RNM Cần Giờ đã được Tổ chức Văn hóa, Khoa học và

Giáo dục LHQ (UNESCO) công nhận là Khu dự trữ sinh quyển của thế giới từ

tháng 1-2000. Đây cũng là Khu dự trữ sinh quyển RNM đầu tiên của nước ta và

cũng được xem lá “lá phổi” rất quan trọng của Tp.HCM [69].

Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng

Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp.HCM:

Về tọa độ địa lý: vĩ độ Bắc 10o

22’ – 100o

40’09”, kinh độ Đông 1060

46’ –

107°00’59”.

Về ranh giới, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển

Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa –

Vũng Tàu. Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35km, từ Đông sang Tây là

30km. Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó:

vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [5].

RNM Cần Giờ phát triển trên nền một đầm mặn mới, do phù sa sông mang

đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng

tụ trầm tích đất sét, phèn hóa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết

chặt nên không có khả năng tạo thành đất nền rắn chắc, có hàm lượng lưu huỳnh

dạng khử khá cao và một lượng muối cao không có lợi cho nông nghiệp [21].

Khí hậu nóng ẩm và chịu chi phối của quy luật gió mùa cận xích đạo với

mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 1 đến tháng 4. Lượng mưa

trung bình từ 1300 đến 1400mm hàng năm. Độ ẩm cao hơn các nơi khác trong khu

vực Tp.HCM: mùa mưa là 79 – 83%, mùa khô là 74 – 77%. Nhiệt độ trung bình là

25,8o

C, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 đến 7o

C. Chế độ bán nhật triều

không đều. Độ mặn dao động 1,8 – 3% [5].

RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng, mấm

trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng xu ổi, trang, đưng v.v… và các loại

nước lợ như bần chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng, v.v… Thảm cỏ

biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác

nông nghiệp được trồng lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa v.v…; các vườn cây ăn

trái.

Thảm TV này là MT sống cho nhiều loài ĐV, theo thống kê năm 1999 như:

trên 700 loài ĐV thuỷ sinh không xương sống, 9 loài lưõng thê, 31 loài bò sát, trên

137 loài cá, khoảng 130 loài chim và nhiều ĐV có xương sống có trong sách đỏ

Việt Nam. Ngoài ra còn có 63 loài phiêu SV, 130 loài tảo [4].

Tuy chưa có nhiều số liệu thống kê về hệ NS RNM Cần Giờ, nhưng chúng ta

có thể thấy các loài TV và ĐV trên chính là nguồn thức ăn tốt nhất cung cấp cho hệ

NS RNM Cần Giờ. NS chính là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là tác

nhân phân giải các chất hữu cơ, cung cấp thức ăn cho các SV khác trong HST, là

một nhân tố không thể thiếu tham gia khép kín chu trình sinh địa hóa của RNM Cần

Giờ. HST này nằm ở lưu vực ven bờ có nhiều thành phần C phức tạp do thủy triều

đưa vào. NS có khả năng sinh các loại amylase, protease, cellulase, chitinase,...phân

hủy các chất hữu cơ đó để sử dụng và đồng thời góp phần làm giảm ô nhiễm MT ở

RNM Cần Giờ. Đặc biệt nơi đây có nguồn tinh bột sẵn có trong lá cây, thân cây

(nhất là lá mục và thân mục) sẽ là nguyên liệu cho amylase phân giải tạo glucose

cho hoạt động sống của chúng.

Hình 1.1. Bản đồ tổng quan về RNM Cần Giờ và vị trí 5 xã thu mẫu [65]

Ký hiệu : vị trí thu mẫu.

Do những đặc điểm trên, RNM Cần Giờ có vai trò là “lá phổi xanh” làm

giảm ô nhiễm MT, giảm sự nóng lên của Trái đất và ngăn ngừa tình trạng dâng lên

của nước biển. RNM Cần Giờ còn là “chiếc lọc sinh học” trong xử lý chất thải, xử

lý chất dinh dưỡng từ đất liền và giữ vai trò vùng đệm chống lại các dòng chảy ô

nhiễm đồng thời lọc thức ăn cho các ĐV biển; giúp bảo vệ các loài ĐV trên đất liền

khi nước triều lên cao và sóng lớn; bảo vệ bờ biển và cửa sông tránh tình trạng tác

hại và xói lở của bão, sóng đối với hệ thống đê biển, giảm chi phí tu bổ đê điều

hàng năm; là nơi có lợi nhuận kinh tế cao, cung cấp nguồn hải sản phong phú để sử

dụng trong nước và xuất khẩu cũng như các nguồn lợi khác từ rừng,....RNM chính

là HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST, nơi hội tụ sự đa dạng của cả

SV biển và đất liền. Vì thế, nó còn là PTN sống để nghiên cứu về khả năng chịu

đựng và phục hồi của các tổ hợp gen, khả năng phát tán và định cư của các dạng

sống [74].

1.2. Sơ lược về NS.

1.2.1. Hình thái và cấu trúc NS.

NS là VSV có nhân chuẩn, dị dưỡng. Sợi nấm có thể có vách ngăn như các

lớp nấm bậc cao như Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes hay không có

vách ngăn như các nấm bậc thấp Oomycetes và Zygomycetes. Các sợi nấm vừa phát

triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn và phân nhánh tạo hệ sợi nấm còn gọi là

khuẩn ty. Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn,

lỏng hay mềm. KL NS phát triển từ một bào tử có dạng tròn hay gần tròn. Bề mặt

KL có thể mượt, nhung mịn, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp,

phẳng, có vết khía xuyên tâm, có rãnh hay lồi lõm không đều; mép KL có thể trơn

hay răng cưa tùy vào từng loại nấm khác nhau [11, 13, 61, 78].

Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số sợi nấm mang sắc tố tạo nên

màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi

màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các

tinh thể trên bề mặt KL. Vì bào tử của nấm thường cũng có màu nên cả KL thường

có màu. Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của KL…có ý nghĩa nhất định trong

việc định tên nấm [3, 61].

NS sinh sản chủ yếu bằng bào tử. Bào tử của NS có thể hình thành theo kiểu

vô tính hay hữu tính. Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong

đó bào tử trần là phổ biến nhất. Trong sinh sản hữu tính, NS có các hình thức đẳng

giao, dị giao và tiếp hợp [11].

NS ngày càng được quan tâm nghiên cứu ngày càng sâu rộng hơn do chúng

có khả năng sinh nhiều các chất có hoạt tính sinh học cao được ứng dụng rộng rãi

đem lại nhiều nguồn lợi kinh tế cao như tạo ra các loại enzym, các chất KS, các axit

hữu cơ, các chất có khả năng phân giải các nguồn cacbuahydro (ứng dụng trong xử

lý ô nhiễm MT do tràn dầu),...

Hình 1.2. Sự phát triển của sợi nấm [61] Hình 1.3. KL của chủng

Penicillium [64]

Hình 1.4. Một số dạng bào tử của NS [68, 70, 79]

 Khả năng sinh các enzym ngoại bào.

Enzym được sản xuất từ VSV ngày càng nhiều. VSV là nhóm đối tượng duy

nhất được sử dụng như nguồn sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp. So với ĐV

và TV, việc thu nhận enzym từ VSV nói chung và NS nói riêng có rất nhiều ưu

điểm như: tốc độ sinh sản nhanh, enzym thu được có hoạt tính rất cao, quá trình

sinh trưởng phát triển và tổng hợp enzym của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào

khí hậu bên ngoài, nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzym theo quy mô công

nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm (đây là lợi thế rất quan trọng) và VSV có thể sinh tổng

hợp cùng một lúc nhiều loại enzym khác nhau. Ngày nay, nhiều loại enzym ngoại

bào của NS đã được nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng phổ biến như: amylase,

protease, cellulase, pectinase, chitinase,....[9, 25].

 Khả năng sinh các chất KS.

KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV

với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển

của VSV khác. KS được tạo ra từ VSV đang rất được quan tâm và ngày càng phát

triển mạnh mẽ trong thời đại hiện nay.

Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỉ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp Nấm

bất toàn. Các chất KS được sử dụng chủ yếu trong y tế hiện nay như Penicillin,

Cephaco-sporin-C,...[11].

 Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng [19,73].

Ngày nay, nhu cầu sử dụng các axit hữu cơ ngày càng nhiều trong thực

phẩm, công nghiệp. Một số axit hữu cơ phổ biến được sản xuất từ NS như: axít

xitric từ Asp.niger; axít gluconic thu nhận từ Asp.niger và Asp. foetidus; axít lactic

sản xuất từ Rhizopus oryzae (Mattey, 1992).

Tại Nhật Bản, các nhà khoa học đã tổng hợp được chất kích thích sinh

trưởng Giberelin từ hai chủng NS Furasium monoforme và Furasium oxysporum.

Ngoài lên men sản xuất KS, enzym, các axit hữu cơ,..., Penicillium

chrysogenum và Asp. niger còn tạo ra một lượng lớn sản phẩm phụ của sự lên men.

Khuẩn ty của nấm không độc là một thành phần thức ăn lý tưởng bởi vì nó có hàm

lượng đạm thô cao (xấp xỉ 12% trên trọng lượng tươi). Khuẩn ty được sử dụng như

thành phần thức ăn gia súc. NS cũng được sử dụng làm giàu thêm đạm cho thức ăn

gia súc,....

Tuy vậy, rất nhiều loài NS cũng gây ra những tác hại cho đời sống như mọc

trên các nguyên vật liệu, đồ dùng, thực phẩm là hư hỏng hay giảm chất lượng sản

phẩm. Một số NS cũng tiết ra độc tố gây ung thư (Asp.flavus sinh độc tố Aflatoxin

gây ung thư gan), gây bệnh cho người, ĐV và TV,...[56, 72, 73, 74].

1.2.2. Phân loại NS.

Hiện nay chỉ mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài trong số

khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm có trong tự nhiên. Riêng các loài nấm thuộc

Nấm bất toàn ở nước ta hiện mới chỉ phát hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác

nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Bảo tàng giống chuẩn VSV (VTCC) thuộc Trung tâm

Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội đang hợp tác với Viện NITE của

Nhật Bản điều tra nghiên cứu khu hệ vi nấm ở Việt Nam và có nhiều khả năng tìm

thấy những loài mới nữa.

Về phân loại nấm, hiện nay tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống

nhất với nhau, chủ yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973),

V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1983), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby

(1995), Alexopoulos & Mins (1996). Trong luận văn này, chúng tôi phân loại nấm

dựa vào các đặc điểm mô tả theo hệ thống phân loại của Ainsworth và cộng sự

(1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Lân Dũng

(2006) [61].

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, để phân loại VSV nói chung,

NS nói riêng, người ta thường dùng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen

(PCR – Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả nhanh và chính xác.

Nguyên tắc của phương pháp PCR là khuếch đại một trình tự lên nhiều lần

bằng một cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu

kỳ gồm 3 bước:

- Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao

chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94 –

95o

C trong vòng 30 giây đến 1 phút.

- Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ

này dao động trong khoảng 40 – 70o

C và kéo dài 30 giây đến 1 phút.

- Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 72o

C để DNA polymerase

hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình

tự DNA, thường kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút.

Sau đó, người ta sẽ tiến hành giải trình tự các axit nucleic

Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên

tắc.