Phát triển kỹ thuật MSP nhằm phát hiện Methyl hóa bất thường Gen Rassf1A hướng đến hỗ trợ chẩn đoán ung thư vòm họng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MSP NHẰM PHÁT

HIỆN SỰ METHYL HÓA BẤT THƯỜNG GEN

RASSF1A HƯỚNG ĐẾN HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN

SỚM UNG THƯ VÒM HỌNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. LAO ĐỨC THUẬN

SVTH: NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

MSSV: 1153010962

Khóa: 2011-2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang ii

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn chân thành đối với PGS. TS. Lê Huyền Ái

Thúy, người luôn đầy nhiệt huyết với khoa học đã truyền cho em ngọn lửa đam mê

trong nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn ThS. Lao Đức Thuận, người thầy đã luôn tận tình hướng

dẫn, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Em chân thành cảm ơn ThS.Trương Kim Phượng cũng đã truyền đạt cho em nhiều

kinh nghiệm đáng quý trong suốt thời gian vừa qua.

Tôi cũng xin cảm ơn các thành viên trong phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử -

Trường ĐH Mở TP.HCM đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã luôn yêu thương, chăm

sóc, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 5, năm 2015

Nguyễn Thị Yến Tuyết

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cơ chế epigenetics bao gồm hiện tượng methyl hóa DNA, biến đổi

histone và micro-RNA

Hình 1.2. Cơ chế biến đổi epgenetics gây im lặng gen

Hình 1.3. Cơ chế methyl hóa DNA

Hình 1.4. Sự methyl hóa DNA trong ung thư

Hình 1.5. Mô hình methyl hóa DNA

Hình 1.6. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong của các loại ung thư tại Việt Nam

Hình 1.7. Giải phẫu vùng hầu họng-cổ

Hình 1.8. Vị trí của gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3

Hình 1.9. Bản đồ của gen RASSF1A (A) và protein RASSF1A (B )

Hình 1.10. Tóm tắt vai trò sinh học của protein RASSF1A

Hình 1.11. APC-Cdc20 bị ức chế suốt quá trình nguyên phân

Hình 1.12. Protein RASSF1A điều hòa chu trình chết thông qua Bax

Hình 1.13. Xử lý sodium bisulfite và sự chuyển đổi cytosine thành uracil

Hình 1.14. Nguyên tắc của kỹ thuật MSP

Hình 2.1. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Hình 3.1. Tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong tế bào ung thư vòm họng và tế

bào bình thường

Hình 3.2. Tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong tế bào ung thư vòm họng theo

loại mẫu sử dụng

Hình 3.3. Tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong tế bào ung thư vòm họng và tế

bào bình thường

Hình 3.3. Định vị gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3

Hình 3.4. Hình A. Sơ đồ hình ảnh các vùng đảo CpG trên trình gen khảo sát; Hình

B. Vùng promoter mồi unmethyl và mồi methyl bắt cặp và các nhấn tố phiên mã

Hình 3.5. Mồi methyl bắt cặp với trình tự RASSF1A đã biến đổi bisulfite

Hình 3.6. Mồi unmethyl bắt cặp với trình tự RASSF1A đã biến đổi bisulfite

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm MSP

Hình 3.8. Kết quả sản phẩm PCR giải trình tự

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Bảng mồi gen RASSF1A tham khảo

Bảng 2.2. Các bước tách chiết DNA

Bảng 2.3. Chuẩn bị ME Wash buffer 1X

Bảng 2.4. Chuẩn bị mẫu

Bảng 2.5. Các bước thực hiện biến đổi bisulfite

Tiến hành đặt phản ứng PCR với hai cặp mồi sau

Bảng 2.6. Mồi methyl và unmethyl cho gen RASSF1A

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR

Bảng 3.1. Phương pháp được sử dụng trong 10 công trình nghiên cứu

Bảng 3.2. Loại mẫu được sử dụng trong 10 nghiên cứu

Bảng 3.3. Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của một số gen RASSF1A,

DAPK, p16 trên bệnh ung thư vòm họng

Bảng 3.4. Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A ở bệnh

ung thư vòm họng phân theo loại mẫu

Bảng 3.5. Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A trong tế

bào ung thư vòm họng và tế bào bình thường

Bảng 3.6. Trình tự mồi và các thông số vật lý được đánh giá bằng phần mềm trực

tuyến IDT

Bảng 3.7. Bảng nồng độ và chất lượng DNA tách chiết từ mẫu giữ trong PBS và

formallin

Bảng 3.8. Bảng kết quả sơ bộ phương pháp MSP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

5mC 5-methylcytosine

APC Anaphase-promoting complex

BSP Bisulftte sequencing

C Cytosine

CDK1 Cyclin-depentdent kinase 1

CpG Cystosine phosphate Guanine

ddH2O Double-distilled H2O

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

DNMT DNA methyltransferase

EBV Epstein-barr virus

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

G Guanidine

JNK Jun-NH2-Kinase

Kb Kilo base pair

MDB methyl-binding protein

MMSP Multiplex Methylation Specific PCR

MOAP1 Modulator of apoptosis 1

MSP Methylation-Specific Polymerase chain reaction

NST Nhiễm sắc thể

OD Optical Density

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang vi

PCR Polymerase Chain Reaction

Pha G Pha GAP

Pha S Pha Synthesis

RASSF1A RAS association domain family member 1

RT-PCR Real time PCR

SAM S-adenosyl-L-methionine

SDS Sodium dodecyl sulfat

Ta Nhiệt độ bắt cặp

TBBT Tế bào bình thường

TBE Tris-Borate-EDTA

TBTS Trung bình có trọng số

TBUT Tế bào ung thư

Tm Nhiệt độ nóng chảy

UTVH Ung thư vòm họng

WHO World Health Organization