Phân Lập Promoter Của Gen Mã Hóa Cho Enzyme Cinnamyt Alcohol Dehydrogenase Cad Biểu Hiện Đặc Hiệu Ở Xylem Từ Cây Bạch Đàn Urô Eucalyptus Urophylia S T Blake

1

MỞ ĐẦU

Lignin là một trong hai loại polymer sinh học phổ biến trong cây, sau

cellulose, và ƣớc tính lignin chiếm 30% lƣợng carbon hữu cơ trong sinh

quyển [27]. Quá trình tổng hợp lignin là một trong những cách thức thích nghi

của thực vật trong quá trình tiến hóa khi thực vật thay đổi môi trƣờng sống từ

nƣớc lên cạn. Lignin giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc

thành tế bào và thân. Thêm vào đó lignin tham gia vào quá trình vận chuyển

nƣớc, các chất dinh dƣỡng thông qua hệ thống bao mạch và giữ vai trò quan

trọng trong việc đảm bảo sự chắc chắn của cây trong không gian, cũng nhƣ

bảo vệ cây khỏi các nhân tố gây bệnh. Hàm lƣợng lignin cao trong gỗ giúp gỗ

bền. Bởi vậy, nó là nguyên liệu thô tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng,

nội thất,...). Nó còn là một loại nhiên liệu hoàn hảo, khi đốt năng lƣợng tỏa ra

từ lignin cao hơn từ cellulose.

Tuy nhiên trong một số lĩnh vực nhƣ sản xuất sợi, sản xuất giấy thì hàm

lƣợng lignin cao lại là một trở ngại. Ví dụ nhƣ trong công nghiệp sản xuất

giấy, lignin làm cho giấy chuyển mầu vàng theo thời gian. Do đó lignin cần

phải đƣợc loại bỏ trƣớc khi sử dụng để sản xuất giấy trắng chất lƣợng cao.

Vậy làm thế nào để điều chỉnh đƣợc hàm lƣợng lignin trong cây theo

hƣớng có lợi cho bản thân sinh vật và con ngƣời, nhƣ: tăng hàm lƣợng lignin

trong cây trồng làm nhiên liệu, trong xây dựng, trong cây nông nghiệp (cây

lúa – chống đổ) hay giảm hàm lƣợng lignin trong cây bạch đàn nhằm tạo

thuận lợi cho quá trình sản xuất giấy.

Đã và đang có rất nhiều nghiên cứu (chủ yếu là ở nƣớc ngoài) về lignin,

quá trình sinh tổng hợp lignin, các enzyme tham gia vào quá trình này nhƣ

enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) và enzyme cinnamyl alcohol

dehydrogenase (CAD), nhƣng đa phần là trên các cây mô hình (Arabidopsis

2

thaliana, Populus trichocarpa). Nhằm mục đích điều khiển sự biểu hiện của

một số enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lignin ở mô phân sinh gỗ

cho một số đối tƣợng cây lâm nghiệp bằng phƣơng pháp chuyển gen, chúng

tôi tiến hành đề tài: “Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme

cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) biểu hiện đặc hiệu ở xylem từ cây

bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake)”. Làm vật liệu để thiết kế

các cấu trúc vector chuyển gen biểu hiện đặc hiệu ở tầng xylem thực vật.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tách dòng và phân tích trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã

hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) từ cây bạch

đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) trồng tại Việt Nam.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1. Tập hợp thông tin về trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã hóa

cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) đã công bố trên

ngân hàng gen quốc tế NCBI và thiết kế cặp mồi để khuếch đại đoạn

promoter này từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake).

2. Tách dòng đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme CAD từ cây

bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake).

3. Phân tích trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã hóa cho

enzyme CAD phân lập đƣợc ở mục 2.

3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây bạch đàn

Bạch đàn là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), bộ Sim

(Myrtaces), phân lớp Hoa Hồng (Rosidae), lớp Hai lá mầm (Dicotyledones).

Tên bạch đàn Eucalyptus lần đầu tiên đƣợc nhà thực vật học ngƣời Pháp

Charles Louis L’Heritier de Brutelle đặt cho vào năm 1788. Từ đó đã có tới

600 loài và biến chủng đƣợc đặt tên và mô tả, gần đây đã chấp nhận trên 500

loài [3]. bạch đàn có xuất xứ từ Australia [3, 4, 23] và chỉ có hai loài bạch đàn

phân bố ngoài Australia là E.deglupta Blume và E. urophylla S.T. Blake. Cho

đến nay, bạch đàn đã đƣợc gây trồng ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các

vùng nhiệt đới và ôn đới, giữa các vĩ độ 45oN và 40oB nhƣ: Braxin, Trung

Quốc, Ấn Độ,… [3].

Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) có nguyên sản ở

Indonesia (tập trung ở một số đảo là Flores, Adona, Pantar, Alor. Wetar và

Timor), phân bố từ 7

o

30 - 10o

vĩ Nam và 122o

- 127o

kinh Đông trên các dốc

núi và trong các thung lũng, trên các loại đất bazan, diệp thạch và phiến thạch,

đôi khi mọc ở vùng núi đá vôi. Bạch đàn urô phân bố ở độ cao 300 – 2960 m

so với mặt nƣớc biển. Bạch đàn urô có thể cao 25 – 45 m, cá biệt có thể cao

55 m, đƣờng kính đạt từ 1 – 2 m [2].

Lần đầu tiên bạch đàn urô có mặt tại Việt Nam trong chƣơng trình khảo

nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn năm 1979 tại vùng nguyện liệu giấy Trung

tâm Bắc Bộ [5]. Các vƣờn giống cây trồng bằng hạt của loài hiện đã đƣợc xây

dựng tại địa bàn các tỉnh Phú Thọ và Hà Tây.

Bạch đàn urô đƣợc đánh giá là loài có dáng rất đẹp, chất lƣợng gỗ tốt.

Gỗ bạch đàn đƣợc sử dụng với rất nhiều mục đích nhƣ: gỗ xây dựng, làm đồ

4

dùng trong gia đình, gỗ trụ mỏ,… Bạch đàn urô đƣợc xem là nguyên liệu

chính cho công nghiệp sản xuất giấy trên thế giới và Việt Nam.

1.2. Những nghiên cứu về bộ gen ở cây bạch đàn

Với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, hiệu suất

cao và tin sinh học nhiều nghiên cứu về bộ gen của nhiều loài cây đã đƣợc

giải mã thành công ví dụ cây Arabidopsis thaliana, và đặc biệt trong số này

bao gồm cả những loài cây quan trọng trong nông nghiệp nhƣ lúa (Oryza

sativa) và trong lâm nghiệp nhƣ cây dƣơng (Populus trichocarpa). Thông tin

về bộ gen của những loài cây này đã trở thành những công cụ rất có giá trị

trong các nghiên cứu về chức năng và sự tƣơng tác giữa các gen, những

nghiên cứu về tiến hoá và sự phân bố gen trong các quần thể thực vật. Thực

vật hạt kín đƣợc cho là có nhiều điểm tƣơng đồng về bộ gen, các quá trình

trao đổi chất với các loài cây mô hình, chính vì vậy mà những nghiên cứu trên

các loài cây này là những thông tin và công cụ quan trọng cho các loài cây

thuộc họ khác ví dụ chi Eucalyptus [6].

Những nghiên cứu về gen trên cây bạch đàn bao gồm nhiều khía cạnh về

cấu trúc, chức năng và thành phần trong trình tự của bộ gen. Đặc điểm của bộ

gen, bao gồm trong nhân và ngoài nhân, đƣợc xác định dựa trên việc tạo ra

bản đồ liên kết các vị trí chỉ thị phân tử và các locus tính trạng số lƣợng.

Những nghiên cứu về chức năng của gen chủ yếu tập trung vào việc tách dòng

và xác định các gen mới, phân tích sự biểu hiện của gen, định vị gen trên các

locus quy định tính trạng số lƣợng, mối liên kết giữa tính đa hình DNA và

hình thái cá thể, và cuối cùng là tạo ra các dòng cây chuyển gen mang các tính

trạng mong muốn.

1.3. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật

1.3.1. Lignin

5

Lignin có cấu trúc phức tạp, là một polyphenol có mạng không gian mở.

Thành phần thay đổi theo từng loại gỗ, tuổi cây hoặc vị trí của nó trong cấu

trúc gỗ. Lignin là các phức hợp dị polymer thơm và hiếm đƣợc tổng hợp từ ba

loại đơn phân hydroxycinnamyl alcohol. Ba loại đơn phân này phân biệt với

nhau tuỳ thuộc vào mức độ methoxyl hóa, với tên hóa học là: p-coumaryl

M1H, coniferyl M1G và sinapyl M1S alcohol [18, 21]. (Hình 1.1)

Hình 1. 1: Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin

Từ ba loại đơn phân này, các chất p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G)và

syringyl (S) phenylpropanoid đƣợc tạo ra. Các chất này sau đó sẽ kết hợp lại

để tạo ra phân tử lingin

Mặc quá trình sinh tổng hợp các monolignol (đơn phân tạo ra lignin) đã

đƣợc xây dựng lại nhiều lần nhƣng đến nay nó vẫn còn là vấn đề bàn cãi trong

các nhà khoa học. Tƣơng tự nhƣ vậy, thì các quá trình khử và polymer hóa

các monolignol trong thành tế bào cũng vẫn là những chủ đề đang đƣợc

nghiên cứu và thảo luận.