Nghiên Cứu Phân Lập Promoter Của Gen Mã Hóa Cho Glycine Rich Protein 1 8 Grp 1 8 Biểu Hiện Đặc Biệt Ở Xylem Từ Cây Đậu Cô Ve Phaseolus Vulgaris L

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam trong vài năm trở lại đây công nghệ

chuyển gen vào tế bào thực vật đang được quan tâm và chú trọng đặc biệt là

lĩnh vực chuyển gen vào cây lâm nghiệp. Đến nay có khoảng 20 nước trồng

khảo nghiệm cây lâm nghiệp biến đổi gen [2]. Trong đó tập trung chủ yếu vào

các gen như: gen chống chịu, gen tăng chất lượng gỗ, gen tăng khả năng sinh

trưởng, gen kháng côn trùng… đặc biệt là gen tăng chất lượng gỗ. Tuy nhiên,

để các cây chuyển gen biểu hiện thành tính trạng mong muốn thì cần thiết

phải có một promoter mạnh điều khiển biểu hiện các gen ngoại lai trong cây

trồng biến đổi gen. Các promoter được sử dụng phổ biến bao gồm: CaMV

35S, CaMV 19S, GRP 1.8, NOS. Promoter GRP 1.8 (Glycine- rich protein

1.8 promoter) có kích thước 614 bp, có khả năng tham gia điều khiển biểu

hiện đặc hiệu ở tầng xylem của thực vật.

Tại Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học Trường Đại học Lâm

Nghiệp đang thực hiện đề tài cấp nhà nước "Nghiên cứu tạo giống Xoan ta

(Melia azedarach L.) biến đổi gen có sức sinh trưởng nhanh, chất lượng gỗ

tốt". Xoan ta là cây sinh trưởng nhanh, đường kính có thể đạt tới 100cm,

chiều cao 30m. Gỗ Xoan ta được sử dụng nhiều trong đóng đồ mộc, đồ gia

dụng, làm vật liệu xây dựng… Tuy nhiên, gỗ Xoan ta khá mềm nên khả năng

chịu lực kém. Để khắc phục nhược điểm này, hướng nghiên cứu chuyển gen

tăng hàm lượng lignin vào Xoan ta để tăng chất lượng gỗ được nhiều nhà

khoa học đánh giá là có tính khả thi cao.

Gen tăng chất lượng gỗ (gen 4CL1) sử dụng để chuyển vào Xoan ta, chỉ

có hiệu quả cao khi gen biểu hiện đặc hiệu ở tầng xylem. Do đó, việc phân

lập được promoter biểu hiện gen đặc hiệu ở tầng xylem là rất có ý nghĩa.

Phân lập được promoter biểu hiện đặc hiệu ở tầng xylem sẽ là nguyên liệu

quan trọng phục vụ cho việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen, đặc biệt

có ý nghĩa đối với gen tăng chất lượng gỗ. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập promoter của gen mã

hóa cho glycine rich protein 1.8 (GRP 1.8) biểu hiện đặc hiệu ở xylem từ

cây Đậu cô ve (Phaseolus vulgaris L.)”.

2

Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Ứng dụng công nghệ gen thực vật

Công nghệ sinh học có thể được chia ra làm 3 thời kì chính là:

Thời kỳ thứ nhất là công nghệ sinh học truyền thống: chế biến các sản

phẩm dân dã đã có từ lâu đời như tương, chao, nước mắm... theo các phương

pháp truyền thống.

Thời kỳ thứ hai là công nghệ sinh học cận hiện đại: có sử dụng công

nghệ trong quá trình chế biến sản xuất các sản phẩm như việc sử dụng các

nồi lên men công nghiệp để sản xuất ở quy mô lớn các sản phẩm hạt như mì

chính, acid amin, acid hữu cơ, chất kháng sinh, vitamin, enzym...

Thời kỳ thứ ba là công nghệ sinh học hiện đại: công nghệ gen, công

nghệ tế bào, công nghệ enzym protein, công nghệ vi sinh, công nghệ lên

men, công nghệ sinh học môi trường, công nghệ sinh học nano, công nghệ

sinh học điện toán [39].

Trong các lĩnh vực của công nghệ sinh học hiện đại, hiện nay công nghệ

gen (gene engineering) được quan tâm và chú trọng nhiều nhất bởi các ứng

dụng cho con người ngày càng không thể phủ nhận. Sự thay đổi có mục đích

của bộ gen (genom) của một cơ thể sinh vật bằng việc chuyển vào genom của

nó một hoặc một số gen từ bên ngoài được gọi là công nghệ gen. Cơ thể được

chuyển gen có thể là thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên hiện nay trên

thế giới cũng như ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào đối tượng là thực vật.

Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa to lớn về mặt khoa học. Thông qua chuyển

gen, chúng ta có thể thấy được vai trò của từng gen đối với thực vật, nghiên

cứu quá trình điều khiển, biểu hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và

ngoại cảnh lên hoạt động của gen.

3

Đối với thực tiễn, công nghệ gen có nhiều ưu điểm so với phương pháp

lai tạo:

1. Lai tạo chỉ cho phép giữa các cơ thể cùng loài hoặc có họ hàng gần

về mặt di truyền còn công nghệ gen có thể chuyển gen có các nguồn khác

nhau như vius, vi khuẩn, nấm men, động vật, thực vật.

2. Gen được chuyển không làm ảnh hưởng tới kiểu hình của cây còn

đối với phương pháp lai tạo truyền thống thường phải chuyển toàn bộ genom

của cây cho vào cây nhận nên rất khó tách riêng các gen có lợi khỏi các gen

không cần thiết, nhất là khi chúng liên kết với nhau dẫn đến việc tạo kiểu hình

không mong đợi.

3. Gen được tách dòng có thể được chuyển vào các giống cây trồng khác nhau

[14].

Theo bản báo cáo tổng kết số 34 năm 2005 của tổ chức ISAAA

(International Service for the Acquisition of the Agribiotech Applications)

tính đến năm 2005 tổng diện tích đất trồng cây biến đổi gen từ trước đến nay

đạt 475 triệu hecta tăng trên 205 lần trong khoảng thời gian 10 năm (từ năm

1996 đến 2005). Tuy nhiên, hiện nay cây trồng biến đổi gen được trồng chủ

yếu ở các nước phát triển, một tỷ lệ nhỏ ở các nước kém phát triển và còn lại

ở các nước đang phát triển. Tổng doanh thu cây trồng biến đổi gen mang lại

kể từ khi được đưa vào thương mại hoá (1996- 2005) khoảng 30 tỷ USD. Như

vậy, trên bình diện toàn cầu chúng ta có thể lạc quan tin rằng diện tích và số

người trồng cây biến đổi gen trên thế giới đặc biệt là các quốc gia đang phát

triển sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới [2].

Phần lớn các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào cây nông nghiệp và đã

thu được rất nhiều thành tựu đáng kể như: chuyển gen kháng sâu bệnh vào

Ngô, gen kháng thuốc diệt cỏ vào Bông, gen kháng vius vào Khoai tây…

Bên cạnh đó, các nghiên cứu về công nghệ chuyển gen trong cây lâm nghiệp

mới chỉ thực sự bắt đầu vào năm 2002 khi Trung Quốc là nước đầu tiên

4

trồng thương mại hoá cây lâm nghiệp biến đổi gen là cây Bạch dương

(Populus nigra) được chuyển gen Bt kháng côn trùng ăn lá,

cây Poplar hybrid 741(P. alba X [P.davidiana + P.simonii] X

(P.tomentosa) được chuyển gen Cry1A(c) và API kháng côn trùng

ăn lá. Chuyển gen vào cây lâm nghiệp chủ y ế u đ ư ợ c t h ự c

h i ệ n t h e o c á c h ư ớ n g như chuyển gen kháng côn trùng, kháng sâu,

kháng thuốc diệt cỏ, gen chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi

trường… Đặc biệt hiện nay gen tăng khả năng sinh trưởng (gen GA20) và

gen tăng chất lượng gỗ (gen 4CL1) là hai gen đang được quan tâm và chú

trọng nhiều nhất. Theo báo cáo của FAO (2004) các nghiên cứu về cải thiện

chất lượng gỗ liên quan đến thành phần lignin chiếm 57%, còn các nghiên

cứu về tăng tốc độ sinh trưởng chỉ chiếm 6%. Các nghiên cứu tập trung vào

con đường sinh tổng hợp lignin thông qua các đặc tính của các enzym và các

gen có liên quan đến con đường tổng hợp này trong cây thân cỏ và

cây trồng (Whetten et al, 1998). Tham gia vào con đường trình

tổng hợp lignin có 3 enzym quan trọng là: 4CL (4-courmarate￾CoA ligase), CAD (cinnamyl alcohol dehyrogenasae ), PAL

(phenylalanine ammonialyase ) [28, 29, 37, 38]. Tuy nhiên,

enzym 4CL là một enzym chìa khóa có vai trò quan trọng trong

việc điều hòa sinh tổng hợp các hợp chất thứ sinh, đặc biệt là

lignin ở thực vật [2]. Lignin (C57H60O11) là hợp chất phenol thơm, trong tự

nhiên chỉ phổ biến sau cellulose [4,5]. Lignin có đặc tính cứng, khi

chất này thấm vào vách tế bào làm cho tế bào trở nên rắn và

chắc [4]. Vì vậy, để tăng cường khả năng tổng hợp lignin trong

tế bào thực vật cây gỗ các nhà nghiên cứu đã tiến hành chuyển

gen 4CL1. Tuy nhiên phần lớn các gen được chuyển vào tế bào

của cây chuyển gen không hoạt động hoặc hoạt động rất yếu. Nguyên

nhân chủ yếu là do các gen này chưa có một vùng điều khiển khởi đầu đặc

hiệu.

5

Đối với nước ta do điều kiện kinh tế còn khó khăn, mặc dù chính phủ đã

quan tâm và đầu tư cho phát triển công nghệ sinh học nhưng vẫn còn rất hạn

chế. Công nghệ gen mới chỉ thực sự bắt đầu ở nước ta trong vài năm trở lại

đây nhưng chúng ta đã thu được một số thành tựu đáng kể, phần lớn các thành

tựu này chủ yếu là các cây nông nghiệp như: Thuốc lá [18], Cà chua, Lúa

[57], Khoai tây...

1.2. Giới thiệu về phân lập gen thông qua PCR

Phân lập (tách dòng) gen là phương pháp thu nhận một lượng lớn bản

sao của một gen mong muốn từ một nguồn DNA nào đó mang gen quan tâm.

Như ta đã biết hầu hết các gen trong tế bào chỉ có một bản duy nhất với

kích thước quá nhỏ bé trong hệ gen khổng lồ. Trong khi đó các nghiên cứu về

công nghệ gen lại cần gen ở dạng độc lập với số lượng bản sao lớn. Vì vậy,

phải tiến hành tách dòng gen nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao của một gen

mong muốn để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo như: xác định

trình tự gen, biểu hiện gen và chuyển gen [12].

Hiện nay có rất nhiều phương pháp phân lập gen như phân lập gen

bằng PCR, thiết kế sàng lọc thư viện cDNA, xác định gen thông qua nghiên

cứu protemomic... Phương pháp phân lập thông qua kỹ thuật PCR là một

phương pháp tuy ra đời sau nhưng tiện lợi, dễ thực hiện, dựa trên cơ sở thông

tin về gen đã được công bố trên Ngân hàng gen [13].

Trên hình 1.1 chúng ta có một cái nhìn chung nhất về phân lập gen

thông qua PCR. Trước hết cần nghiên cứu, xác định được gen quan tâm, dựa

vào trình tự gen được công bố trên Ngân hàng gen để thiết kế cặp mồi đặc

hiệu. Sau khi, tách chiết được DNA tổng số từ vật liệu nghiên cứu, tiến hành

PCR với cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen quan tâm, DNA ngoại lai được

nối vào một vector tách dòng nhằm tạo ra plasmid tái tổ hợp. Tiếp đó, vector

tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ được nuôi cấy trong

môi trường chọn lọc thích hợp. Qua các bước tách chiết plasmid, ta sẽ thu

được một lượng lớn vector mang đoạn DNA ngoại lai. Sau đó tiến hành giải