Phân lập SUS1 Promoter từ cây ngô và thiết kế vector biểu hiện chứa SUS1 promoter và Gen Cryia (C)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN THỊ TÌNH

PHÂN LẬP SUS1 PROMOTER

TỪ CÂY NGÔ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN

CHỨA SUS1 PROMOTER VÀ GEN CRYIA(C)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN THỊ TÌNH

PHÂN LẬP SUS1 PROMOTER

TỪ CÂY NGÔ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN

CHỨA SUS1 PROMOTER VÀ GEN CRYIA(C)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60. 42. 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. NÔNG VĂN HẢI

THÁI NGUYÊN - 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung

thực và chƣa hề đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào.

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc

cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả

Nguyễn Thị Tình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ii

LỜICẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy PGS. TS. Nông Văn

Hải – Phó viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Giám đốc phòng thí nghiệm

trọng điểm – Trưởng phòng Công nghệ ADN ứng dụng đã tận tình chỉ dẫn, giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập thực hiện luận văn tại Viện công nghệ sinh học.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS - NCS Huỳnh Thị Thu Huệ, TS. Lê

Thị Thu Hiền, CN. Dương Thị Thu Hà, cùng toàn bộ cán bộ, đồng nghiệp trong

phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, động viên

tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Phòng Thí nghiệm trong

thời gian thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng

Công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm

2020 của Bộ Nông Nghiệp và phát triển Nông thôn đã tạo điều kiện cho thực hiện

luận văn này trong khuôn khổ đề tài mã số CNSH. ĐT .03/06 -2010.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô khoa Sinh trường Đại học Sư

Phạm Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

tại khoa. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sư

Phạm, Đại học Thái Nguyên, Các thầy cô Khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư

phạm Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình

học tập tại trường.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã nhiệt tình động viên,

giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống. Sự tin

tưởng và khích lệ từ gia đình đã giúp tôi vững vàng, toàn tâm, toàn ý cho công việc.

Từ trái tim mình, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người !

Thái Nguyên, ngày 22 tháng 9 năm 2011

Tác giả

Nguyễn Thị Tình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 3

1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các gen kháng sâu Bt trong tạo cây

trồng chuyển gen có khả năng kháng sâu tự nhiên........................................ 3

1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry........................ 4

1.2.1. Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis......................... 4

1.2.2. Một số nghiên cứu về gen Cry.......................................................... 5

1.2.3. Một số nghiên cứu về gen cryIA(c)................................................. 8

1.3. Promoter và vai trò điều khiển biểu hiện gen ......................................... 9

1.3.1. Cấu trúc của gen ............................................................................... 9

1.3.2. Cấu trúc promoter........................................................................... 10

1.3.3. Vai trò điều khiển biểu hiện gen của promoter .............................. 12

1.3.4. Những nghiên cứu Sus1 promoter.................................................. 15

1.4. Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật.......... 17

1.4.1. Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens.......................... 17

1.4.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid ......................................... 18

1.4.3 Cấu trúc và chức năng của các đoạn T- DNA .............................. 19

1.4.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium

tumefaciens ............................................................................................... 19

1.4.5 Tƣơng tác giữa T - DNA và genome tế bào thực vật .................... 21

1.4.6 Một số phƣơng pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens...................................................................... 22

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 24

2.1. Nguyên liệu........................................................................................... 24

2.2. PHƢƠNG PHÁP................................................................................... 27

2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số mầm ngô ............................ 27

2.2.2. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose................................... 28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

iv

2.2.3. PCR (Polymerase chain reaction)................................................... 30

2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế.................................................. 31

2.2.5. Phản ứng nối ghép gen.................................................................... 32

2.2.6. Biến nạp plasmid ............................................................................ 32

2.2.7. Tách chiết DNA plasmid ................................................................ 34

2.2.8. Tinh sạch ADN từ gel agarose bằng cột......................................... 35

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 36

3.1. Phân lập Sus1 promoter từ mầm ngô.................................................... 36

3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mầm ngô......................... 36

3.1.2. Tách dòng đoạn Sus1 promoter trong pJET 1.2/blunt................... 39

3.1.3. Trình tự đoạn Sus1 promoter.......................................................... 42

3.2. Thiết kế vector biểu hiện gen thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter và

gen cryIA(c)................................................................................................. 45

3.2.1. Chuyển promoter Sus1 vào vector trung gian pRTRA7/3 ............ 46

3.2.2. Chuyển kết cấu biểu hiện chứa Sus1 promoter và gen cryIA(c) vào

pCB301 ..................................................................................................... 49

3.3. Chuyển kết cấu Sus1 promoter và cryIA(c) trong pCB301 vào A.

tumefaciens................................................................................................... 50

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................... 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

v

DANH MỤC CÁC CHỮVIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ

Amp Ampicilin

Bp Cặp base (base pair)

Bt Bacillus thuringiensis

ddNTP DideoxyNucleoside triphosphate

DNA DeoxyriboNucleoic acid

dNTP Deoxy ribo Nucleoside triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EtOH Cồn (Ethanol)

Kb Kilo base (1kb = 1000bp)

kDa KiloDalton

LB Luria Broth

PCR Phản ứng chuỗi Polymerase phiên mã ngược

Pcb Vector pCB301 –Kan

pJET Vector pJET 1.2/blunt

Rif Rifamycin

RT- PCR Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

Tm Nhiệt độ nóng chảy (melting temperature)

v/p Vòng/phút

Đtg Đồng tác giả

.