Phân lập Promoter của Gen mã hóa cho Enzyme Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) và thiết kế Vector chuyển Gen mang đoạn Gen mã hóa cho enzyme Cinnamoyl CoA Reductase (CCR) từ câ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

LÊ PHƢƠNG DUNG

PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL

ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN

GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL CoA

REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS

UROPHYLLA S.T. BLAKE)

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

THAI NGUYEN UNIVERSITY

COLLEGE OF EDUCATION

LE PHUONG DUNG

CLONING PROMOTER REGION OF GENE ENCODING CINNAMYL

ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) AND CONSTRUCTING PLANT

TRANSFORMATION VECTOR CARRYING CINNAMOYL CoA

REDUCTASE GENE FROM EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T. BLAKE

Speciality: Genetics

Code: 60.42.70

MASTER’S THESIS SUMMARY

Supervisor: Dr. Nguyen Huu Cuong

Thai Nguyen, 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả

nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa có ai công bố trong

một công trình nào khác.

Tác giả

Lê Phƣơng Dung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................

1.1.Tổng quan về cây bạch đàn.........................................................................

1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam........................................................

1.3. Tình hình sinh trƣởng của cây bạch đàn ở Việt Nam …………………….

1.4.Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật.....................................

1.4.1. Lignin ..................................................................................................

1.4.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật.............................................

1.4.3. Giới thiệu về gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase

(CAD)

1.5.Tổng quan về promoter...............................................................................

1.5.1. Mô hình điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn. .......................

1.5.2. Cấu trúc và chức năng của promoter....................................................

1.5.3. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học...........................

1.5.4. Promoter điểu khiển hoạt động gen ở tầng xylem Error! Bookmark

not defined.

1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................

2.1.Vật liệu nghiên cứu.....................................................................................

2.1.1. Vật liệu: ...............................................................................................

2.1.2. Hoá chất:..............................................................................................

2.1.3. Máy móc, thiết bị.................................................................................

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu

2.2.Phƣơng pháp nghiên cứu.............................................................................

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

2.2.1. Phƣơng pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme

CAD trên ngân hàng gen quốc tế.......................................................................

2.2.2. Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng gen/promoter.....................................

2.2.3. Tách chiết và tinh sạch DNA – RNA từ mô gỗ ....................................

2.3.4. Tổng hợp cDNA

2.2.5. Khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn gen CCR bằng phản ứng

PCR .....

2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng .......................................................................

2.2.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Error!

Bookmark not defined.

2.2.8. Phƣơng pháp xác định trình tự của gen. ...............................................

2.2.9. Phƣơng pháp Gateway. ........................................................................

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................

3.1. Tách chiết DNA bạch đàn...........................................................................

3.2. Khuếch đại promoter bằng PCR .................................................................

3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD..............................

3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp ....................................

3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5. ................

3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp. .....................................

3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp...................................................................

3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD2....

3.3.6. Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của

promoter gen CAD tách dòng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T

Blake.................................................................................................................

3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl

alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI ...................................

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết … 19

Bảng2.2. Thành phần dung dịch đệm tách chiết ... 21

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khử DNA ... 22

Bảng 2.4A. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 23

Bảng 2.4B. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 23

Bảng 2.4C. Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA ... 24

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR ... 24

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng ..26

Bảng 2.7. Thành phần hoá chất tách plasmid .. 28

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt ... 29

Bảng 2.9. Thành phần phản ứng colony-PCR ...29

Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối ... 31

Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR ... 32

Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR ... 33

Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR .. 34

Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi ... 35

Bảng 3.2. Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R ...

52

Bảng 3.3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp

pBENDER/CCR bằng XhoI ... 64

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin …………………………………... 9

Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin trong thực vật .................................................. 10

Hình 1.3.Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B)..15

Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ......................................................... 25

Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT ..................................................................................... 26

Hình 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR ........................................... 30

Hình 2.4. Sơ đồ vector pENTRTM/D-TOPO

......................................................... 31

Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER .................................................................... 32

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn ....................... 34

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 .................... 35

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 .................... 36

Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch.....37

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch .37

Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến .................... 39

Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .....41

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .... 41

Hình 3.9: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α ……. 42

Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter

CAD1 ................................................................................................................ 43

Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter

CAD2 ................................................................................................................. 44

Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và

CAD2 ................................................................................................................. 45

Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii ............ 46

Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD ……………………….. 48

Hình 3.15: Kết quả điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% .............................. 51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.16: Kết quả điện di khử DNA ................................................................ 51

Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR .......................................... 53

Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% .... 54

Hình 3.19. Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại của gen CCR ..................... 56

Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả

biến E.Coli DH5 ...... 56

Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR .... 58

Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CCR ...

59

Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R

.... 61

Hình 3.24. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR .... 61

Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI .. 62