Nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β-galactosidase từ Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 phân lập ở Việt Nam bằng kỹ thuật ep-RCA và đột biến điểm định hướng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ

GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA

-GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis

VTCC-DVN-12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ

ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn Thị Thảo

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ

GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA

-GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis VTCC-DVN￾12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT

ep-RCA VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Quyền Đình Thi

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2017

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới cố PGS. TS Quyền Đình Thi, nguyên

Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, nguyên Phó Viện trưởng Viện Công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng

nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, biên tập bản thảo bài báo và tạo mọi điều kiện hóa

chất, thiết bị cũng như kinh phí để hoàn thành Luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Văn Hạnh, Trưởng phòng Các chất chức

năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã sửa các bản thảo bài báo và cho tôi sử

dụng số liệu trong khuôn khổ đề tài “Nâng cao hoạt tính xúc tác của enzyme tái tổ

hợp β-galactosidase bằng kỹ thuật sao chép lỗi DNA vòng và đột biến điểm trực

tiếp” thuộc đề tài Nghiên cứu cơ bản 2011-2012 của Quỹ phát triển Khoa học và

Công nghệ Quốc gia do TS làm chủ nhiệm.

Tôi xin cảm ơn GS. TS Trương Nam Hải, nguyên Trưởng phòng Kỹ thuật di

truyền, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ hướng dẫn phân

tích cấu trúc enzyme.

Tôi xin cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, phụ trách phòng Công nghệ sinh học Enzyme,

Viện Công nghệ sinh học đã giúp tôi hoàn thành các thủ tục để bảo vệ Luận án ở các

cấp. Tôi cũng xin cảm ơn tập thể Phòng CNSH Enzyme, đã tạo điều kiện về thời gian,

chia sẻ chuyên môn và giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện Luận án.

Tôi xin cảm ơn Phòng quản lý tổng hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công

nghệ gen, các cán bộ tại cơ sở đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, máy

móc và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ,

tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.

Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017

Tác giả

Nguyễn Thị Thảo

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

1. Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các

cộng sự khác;

2. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn án là trung thực, một phần đã

được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép

của các đồng tác giả;

3. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017

Tác giả

Nguyễn Thị Thảo

iii

CÁC TỪ VIẾT TẮT

bp Base pair (cặp bazơ)

BOD Biochemical oxygen demand (Nhu cầu oxy sinh hóa)

BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò)

cfu Colony forming unit (Đơn vị xác định số lượng tế bào riêng rẽ

của vi khuẩn hoặc nấm)

COD Chemical oxygen demand (Nhu cầu oxy hóa học)

CS Cộng sự

DNA Deoxyribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic)

ep-RCA Error prone rolling circle amplification (Sao chép vòng tạo lỗi)

Gal Galactose (đường galactozơ)

Glc Glucose (đường glucozơ)

GHF Glycoside hydrolase family (Họ các enzym thủy phân liên kết

glycozit)

GOS Galactose-oligossacharide

IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

kb Kilo base (Đơn vị đo kích thước của phân tử ADN)

kDa Kilo Dalton (Đơn vị đo khối lượng của phân tử protein)

M Marker (Thang chuẩn)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

oNP Ortho-Nitrophenyl

oNPG Ortho-Nitrophenyl--D-galactopyranoside

pNPG/pNP-gal para-Nitrophenyl--D-galactopyranoside

pNP-fuc para-Nitrophenyl--D-fucopyranoside

rpm Round per minute (Vòng/phút)

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

(Điện di gel polyacrylamit có bổ sung sodium dodecyl sulfate)

SOC Super optimal broth (Môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn)

TIM Triose-phosphate isomerase

TLC Thin-layer chromatography (Sắc ký bản mỏng)

TE Tris EDTA

TBE Tris boric acid EDTA

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamine

v/v Volume/volume (Thể tích/thể tích)

w/v Weight/volume (Trọng lượng/thể tích)

WT Wild type (Dạng ban đầu)

iv

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. ii

CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................................ iii

MỤC LỤC ....................................................................................................................... iv

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ vii

DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... ix

DANH MỤC PHỤ LỤC .................................................................................................. xi

MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................................4

1.1 Thông tin chung về -galactosidase ............................................................. 4

1.1.1 Định nghĩa ..................................................................................................... 4

1.1.2 Nguồn gốc và phân loại .................................................................................. 4

1.1.3 Cấu trúc ......................................................................................................... 8

1.1.4 Cơ chế phản ứng .......................................................................................... 15

1.2 Ứng dụng ................................................................................................. 18

1.2.1 Trong công nghiệp chế biến sữa ................................................................... 19

1.2.2 Trong xử lý whey ......................................................................................... 20

1.2.3 Trong y dược................................................................................................ 23

1.2.4 Một số ứng dụng khác .................................................................................. 24

1.3 Tình hình nghiên cứu β-galactosidase trong và ngoài nước ........................ 25

1.3.1 Các hướng nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 25

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước ........................................................................... 31

1.3.3 Hướng nghiên cứu của đề tài ........................................................................ 32

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 35

2.1 Vật liệu và hóa chất .................................................................................. 35

2.1.1 Vật liệu ........................................................................................................ 35

2.1.2 Hóa chất và dung dịch .................................................................................. 36

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm ....................................................................................... 38

2.2 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 38

v

2.2.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA .......................................................... 38

2.2.2 Xây dựng thư viện các dòng mang gen lacA đột biến ................................... 41

2.2.3 Tạo đột biến điểm và đột biến điểm suy biến ............................................... 42

2.2.4 Xây dựng và phân tích cấu trúc enzyme ....................................................... 43

2.2.5 Sàng lọc hoạt tính -galactosidase từ các dòng mang gen lacA đột biến ....... 43

2.2.6 Tách DNA plasmid ...................................................................................... 44

2.2.7 Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn ............................................................... 45

2.2.8 Điện di agarose ............................................................................................ 45

2.2.9 Xác định trình tự DNA ................................................................................. 45

2.2.10 Biểu hiện và tinh sạch LacA tái tổ hợp ......................................................... 45

2.2.11 Điện di SDS-PAGE ...................................................................................... 46

2.2.12 Xác định hàm lượng protein ......................................................................... 47

2.2.13 Xác định hoạt tính thủy phân của -galactosidase ......................................... 48

2.2.14 Xác định khả năng chuyển hóa glycoside của -galactosidase ...................... 49

2.2.15 Đặc điểm của LacA tự nhiên và đột biến ...................................................... 50

2.2.16 Xử lý số liệu ................................................................................................. 52

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................................................................... 53

3.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên............................................................................ 54

3.1.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA .......................................................... 54

3.1.2 Tạo thư viện các dòng mang gen lacA đột biến và sàng lọc hoạt tính ............ 57

3.1.3 Phân tích trình tự các dòng đột biến .............................................................. 59

3.1.4 Xác định điểm đột biến làm thay đổi hoạt tính LacA .................................... 60

3.2 Tạo đột biến điểm suy biến........................................................................ 66

3.2.1 Xác định vùng liên kết cơ chất của LacA ...................................................... 67

3.2.2 Tạo thư viện đột biến điểm suy biến ............................................................. 68

3.2.3 Sàng lọc hoạt tính và chọn dòng ................................................................... 69

3.2.4 Phân tích trình tự các dòng đột biến .............................................................. 69

3.2.5 Tinh sạch và xác định hoạt tính riêng của LacA đột biến điểm suy biến .............. 72

3.3 Đánh giá tính chất lý hóa của các LacA đột biến ........................................ 77

3.3.1 Nhiệt độ hoạt động tối ưu ............................................................................. 78

3.3.2 pH hoạt động tối ưu ...................................................................................... 79

3.3.3 Ảnh hưởng của pH đến độ bền LacA tự nhiên và đột biến ............................ 80

vi

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền LacA tự nhiên và đột biến .................... 81

3.3.5 Động học của LacA tự nhiên và đột biến ...................................................... 85

3.3.6 Ảnh hưởng của đột biến đến khả năng tạo oligosaccharide ........................... 86

3.4 Phân tích sự ảnh hưởng của các đột biến đến cấu trúc của LacA ............... 88

3.4.1 Ảnh hưởng của vị trí Ala301 đến cấu trúc của LacA ..................................... 88

3.4.2 Ảnh hưởng của vị trí Phe361 đến cấu trúc của LacA .................................... 91

3.4.3 Ảnh hưởng của vị trí Leu373 đến cấu trúc của LacA .................................... 93

CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN ............................................................................................................................. 97

4.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA ...................................................... 97

4.2 Đánh giá ảnh hưởng của các vị trí đột biến tìm được trên LacA ................. 98

4.2.1 Ảnh hưởng của axit amin Ala301 ................................................................. 99

4.2.2 Ảnh hưởng của các axit amin dự đoán liên kết với cơ chất ......................... 103

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................ 112

CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .......................................................... 113

THESIS ABSTRACT ................................................................................................... 114

TÀI LỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 121

PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc -galactosidase của E. coli thuộc họ GHF-2. ................................................................ 10

Hình 1.2. Cấu trúc của -galactosidase từ K. lactis. ................................................................................................ 10

Hình 1.3. So sánh cấu trúc -galactosidase từ người với một số vi sinh vật khác ................................ 11

Hình 1.4. Cấu trúc của -galactosidase từ B. circulans ATCC 31382. ................................................................ 12

Hình 1.5. Cấu trúc không gian 3 chiều và vùng trung tâm hoạt động của LacA. ................................ 14

Hình 1.6. Động học phản ứng thủy phân lactose của -galactosidase................................................................. 16

Hình 1.7. Động học phản ứng thủy phân lactose của -galactosidase với hai axit glutamic

trong trung tâm hoạt động. ................................................................................................................................

17

Hình 1.8. Sự tổng hợp oligosaccharide. ................................................................................................22

Hình 1.9. Sơ đồ so sánh phương pháp error prone-RCA với các phương pháp đột biến

ngẫu nhiên khác. ................................................................................................................................

33

Hình 2.1. Cơ chế tạo đột biến ngẫu nhiên bằng sao chép lỗi vòng DNA................................................................. 40

Hình 2.2. Các bước trong quá trình tạo đột biến định hướng. ................................................................ 42

Hình 2.3. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo Bradford. ................................ 48

Hình 2.4. Sự thủy phân của oNPG bởi -galactosidase. ................................................................................................ 49

Hình 2.5. Đồ thị Lineawever-Burk. ................................................................................................................................ 51

Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm plasmid pELacA sau phản ứng ep-RCA. ................................................................ 55

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pELacA từ các dòng trong thư viện đột biến

ngẫu nhiên bằng BamHI và NotI ................................................................................................

57

Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR khuôn pELacA với các cặp mồi đột biến. ................................ 60

Hình 3.4A. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Glu62 trên LacA ................................ 61

Hình 3.4B. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Arg77 trên LacA ................................ 61

Hình 3.4C. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala191 trên LacA ................................ 62

Hình 3.4D. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin A301 trên LacA ................................ 62

Hình 3.4E. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Phe361 trên LacA ................................ 62

Hình 3.4F. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala429 trên LacA ................................ 63

Hình 3.4G. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala524 trên LacA ................................ 63

Hình 3.5. SDS-PAGE protein tổng số của các dòng đột biến điểm biểu hiện LacA. ................................ 64

Hình 3.6. SDS-PAGE LacA tinh sạch từ các dòng đột biến điểm. ................................................................ 64

Hình 3.7. Kết quả dự đoán các vị trí axit amin tương tác với cơ chất theo chương trình

SWISS-MODEL. ................................................................................................................................

67

Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại khuôn pElacA với các cặp mồi đột biến................................. 68

viii

Hình 3.9. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala301 trên LacA-WT

và các LacA đột biến.................................................................................................................................

70

Hình 3.10. Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Leu373 trên LacA-WT

và các LacA đột biến.................................................................................................................................

72

Hình 3.11. SDS-PAGE protein tổng số của một số dòng đột biến điểm biểu hiện LacA. ................................ 73

Hình 3.12. SDS-PAGE LacA tinh sạch từ một số dòng đột biến điểm. ................................................................ 74

Hình 3.13. Nhiệt độ hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến. ................................................................ 78

Hình 3.14. pH hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến. ................................................................ 79

Hình 3.15. Ảnh hưởng pH đến độ bền LacA-WT và các LacA đột biến ở pH 4. ................................ 81

Hình 3.16. Độ bền của LacA-WT và các LacA đột biến ở 45 và 50C. ................................................................ 82

Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính LacA và các đột biến. ................................ 85

Hình 3.18A. Sắc ký bản mỏng sản phẩm chuyển hóa của LacA-WT và các LacA đột biến tại

vị trí 301. ................................................................................................................................................................

87

Hình 3.18B. Sắc ký bản mỏng sản phẩm chuyển hóa của LacA-WT và các LacA đột biến tại

vị trí Phe361 và Leu373. ................................................................................................................................

88

Hình 3.19. Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến ở vị trí Ala301. ................................ 89

Hình 3.20. Mối tương tác với cơ chất trong vùng xúc tác của LacA-WT và các đột biến tại

Ala301. ................................................................................................................................................................

90

Hình 3.21. Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến Phe361Tyr. ................................ 91

Hình 3.22. Kết quả phân tích cấu trúc 3D của LacA-WT và LacA-361Tyr. ................................................................ 92

Hình 3.23. Kết quả phân tích mối tương tác với cơ chất trong vùng trung tâm LacA-WT và

LacA-361Tyr. ................................................................................................................................

92

Hình 3.24. Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến tại Leu373. ................................ 94

Hình 3.25. Kết quả phân tích mối tương tác với cơ chất trong vùng trung tâm LacA-WT và

LacA đột biến tại Leu373. ................................................................................................................................

95

Hình 4.1. Sự phân bố của các đột biến nucleotide trên gen lacA. ................................................................ 97

Hình 4.2. Trình tự một phần của -galactosidase thuộc họ 42 từ các loài khác nhau. ................................ 100

ix

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Nguồn -galactosidase từ vi sinh vật................................................................................................ 6

Bảng 1.2. Độ tương đồng về trình tự axit amin của LacA với một số -galactosidase khác................................ 15

Bảng 1.3. Các vị trí axit amin của LacA được dự đoán liên kết với cơ chất ................................................................ 15

Bảng 1.4. Tính chất của một số -galactosidase từ vi sinh vật ................................................................19

Bảng 1.5. β-Galactosidase hoạt động ở nhiệt độ thấp và độ bền nhiệt ................................................................ 25

Bảng 2.1. Các cặp mồi tạo đột biến điểm ............................................................................................................................ 35

Bảng 2.2. Các cặp mồi đột biến điểm suy biến................................................................................................ 36

Bảng 2.3. Các hóa chất thí nghiệm chính ............................................................................................................................ 36

Bảng 2.4. Thành phần các loại đệm và dung dịch................................................................................................ 37

Bảng 2.5. Các thiết bị thí nghiệm ................................................................................................................................ 38

Bảng 2.6. Thành phần gel cô và gel tách ............................................................................................................................. 47

Bảng 2.7. Quan hệ giữ 1/V và 1/[S] ................................................................................................ 51

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ MnCl2 đến khả năng khuếch đại DNA trong phản ứng RCA ............................. 55

Bảng 3.2. Tần suất đột biến nucleotide trên gen lacA ở các nồng độ MnCl2 khác nhau ................................ 56

Bảng 3.3. Các dạng đột biến nucleotide trong phản ứng RCA ở nồng độ 1,5 mM MnCl2................................ 56

Bảng 3.4. Sàng lọc hoạt tính LacA của các dòng có khả năng mang gen lacA đột biến................................ 58

Bảng 3.5. Hoạt tính LacA còn lại của một số dòng LacA đột biến sau khi ủ ở 50C ................................ 59

Bảng 3.6. Các axit amin đột biến của LacA từ một số dòng có hoạt tính thay đổi so với dòng

ban đầu ................................................................................................................................................................ 59

Bảng 3.7 Các bước tinh sạch LacA-WT và các LacA đột biến ngẫu nhiên từ E. coli

JM109(DE3) ................................................................................................................................65

Bảng 3.8. Hoạt tính của LacA ban đầu và LacA đột biến................................................................................................ 66

Bảng 3.9. Sàng lọc hoạt tính các dòng đột biến ................................................................................................ 69

Bảng 3.10. Đột biến thay thế axit amin khác nhau tại một số vị trí trên LacA. ................................................................ 71

Bảng 3.11. Tinh sạch LacA-WT và các LacA đột biến điểm suy biến từ E. coli JM109(DE3) ................................ 75

Bảng 3.12. Hoạt tính đặc hiệu của LacA ban đầu và LacA đột biến với cơ chất oNPG ................................ 77

Bảng 3.13. Độ bền pH của LacA-WT và các LacA đột biến ............................................................................................. 80

Bảng 3.14. Thời gian bán hủy của LacA-WT và các LacA đột biến ................................................................ 84

Bảng 3.15. Các thông số động học của LacA-WT và đột biến với cơ chất oNPG ................................86

Bảng 3.16. Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong

vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí Ala301 ................................................................ 89

Bảng 3.17. So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất ở LacA 90

x

đột biến tại Ala301 ................................................................................................................................

Bảng 3.18. So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất khi Tyr

thay thế cho Phe ở vị trí 361 ................................................................................................................................ 93

Bảng 3.19. Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong

vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí Phe361 ................................................................

93

Bảng 3.20. Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong

vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí 373 ................................................................ 94

Bảng 3.21. So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất khi Tyr

thay thế cho Phe ở vị trí 373 ................................................................................................................................ 95

xi

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 120 trên gen lacA của một số dòng đột biến ................................ 1

Phụ lục 2. Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí W331 trên gen lacA của một số dòng đột biến ................................ 1

Phụ lục 3. Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 361 trên gen lacA ................................................................ 2

Phụ lục 4. Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 371, 373 và 374 của một số dòng đột biến ................................ 2

Phụ lục 5. Hoạt tính đặc hiệu của LacA ban đầu và LacA đột biến với cơ chất oNPG ................................ 3

Phụ lục 6. Nhiệt độ hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến ................................................................ 3

Phụ lục 7. pH hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến ................................................................ 4

Phụ lục 8. Độ bền pH của LacA-WT ................................................................................................................................ 5

Phụ lục 9. Độ bền pH của LacA đột biến A301E ................................................................................................ 6

Phụ lục 10. Độ bền pH của LacA đột biến A301Y ................................................................................................ 7

Phụ lục 11. Độ bền pH của LacA đột biến A301V ................................................................................................ 8

Phụ lục 12. Độ bền pH của LacA đột biến F361Y ................................................................................................ 9

Phụ lục 13. Độ bền pH của LacA đột biến L373C ................................................................................................ 10

Phụ lục 14. Độ bền pH của LacA đột biến L373M ................................................................................................ 11

Phụ lục 15. Độ bền nhiệt của LacA-WT và các LacA đột biến ở 30 và 40C ................................................................ 12

Phụ lục 16. Độ bền nhiệt của LacA-WT ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................................................ 14

Phụ lục 17. Độ bền nhiệt của LacA-301E ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................................................ 15

Phụ lục 18. Độ bền nhiệt của LacA-301V ở các nồng độ cơ chất khác nhau................................................................ 16

Phụ lục 19. Độ bền nhiệt của LacA-301Y ở các nồng độ cơ chất khác nhau................................................................ 17

Phụ lục 20. Độ bền nhiệt của LacA đột biến Y361F ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................ 18

Phụ lục 21. Độ bền nhiệt của LacA đột biến L373C ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................ 20

Phụ lục 22. Độ bền nhiệt của LacA đột biến L373M ở các nồng độ cơ chất khác nhau ................................ 21

Phụ lục 23. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của LacA-WT và biến thể ................................ 22

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

-Galactosidase (hay còn gọi là lactase), thuộc nhóm các enzyme chuyển hóa

saccharide, cắt các gốc -D-galactose từ đầu không khử của các -galactoside

galactoside của các poly- và oligosaccharide hoặc các sản phẩm chuyển hóa bậc hai.

Enzyme này phổ biến trong tự nhiên và được tìm thấy ở vi sinh vật, thực vật, động

vật và người. Trong đó, -galactosidase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi sinh vật

như nấm men, nấm mốc và vi khuẩn và đây cũng là nguồn enzyme có giá trị thương

mại hơn so với từ thực vật và động vật vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng nhanh và

năng suất tổng hợp cao.

-Galactosidase được ứng dụng nhiều trong y dược, môi trường, công nghệ sinh

học và đặc biệt là công nghiệp chế biến sữa. Với 75% dân số trên thế giới thiếu hụt

enzyme lactase để phân giải lactose của sữa, nên đây được xem là một ứng dụng

quan trọng của -galactosidase trong ngành công nghiệp này. Ngoài ra -

galactosidase còn được bổ sung vào quá trình lên men bơ sữa để tránh sự kết tinh

của lactose ở nhiệt độ thấp và tăng độ ngọt cho sản phẩm. Đặc biệt gần đây, -

galactosidase đã được khai thác mạnh vào việc sản xuất thực phẩm chức năng là

tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS) nhờ hoạt tính chuyển gốc glycosyl trong

quá trình thủy phân lactose trong sữa để tạo thành các oligosaccharide. GOS được

sử dụng như nguồn thức ăn không tiêu hóa (prebiotic) để kích thích hệ vi khuẩn hữu

ích đã hiện diện trong đường ruột. Để đáp ứng nhu cầu trong ngành công nghiệp

này, -galactosidase từ rất nhiều nguồn vi sinh vật đã được nghiên cứu khai thác.

Trong số này -galactosidase từ B. subtilis cũng rất được chú ý bởi khả năng hoạt

động tối ưu trong khoảng pH 6-7, bền ở nhiệt độ 30-40C rất thích hợp cho ứng

dụng thủy phân lactose trong sữa cũng như trong các sản phẩm chế biến khác từ sữa.

Đây cũng là một enzyme có tiềm năng để ứng dụng trong một số lĩnh vực khác và

B. subtilis cũng đã được biết là một chủng an toàn được sử dụng rộng rãi trong công

nghiệp thực phẩm.

2

Bên cạnh đó, để chủ động hơn trong việc ứng dụng cũng như lĩnh vực ứng dụng,

ngoài việc sàng lọc và tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp các enzyme mới có hiệu

suất xúc tác cao và tính chất như mong đợi, sự phát triển của công nghệ DNA cũng

cho phép chúng ta có thể chủ động hơn trong việc cải biến protein/enzyme để nâng

cao hiệu suất xúc tác cũng như phát triển các tính chất mới của enzyme. Phương

pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trong in vitro hoặc in vivo cùng với việc lựa chọn di

truyền và phương pháp sàng lọc nhanh, là những công cụ mạnh để phát triển

enzyme với những đặc tính mới so với ban đầu.

Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vai trò

của một số gốc axit amin đối với tính chất của β-galactosidase từ Bacillus subtilis

VTCC-DVN-12-01 phân lập ở Việt Nam bằng kỹ thuật ep-RCA và đột biến điểm

định hướng”.

2. Mục đích nghiên cứu

- Xác định vai trò của một số axit amin quan trọng của -galactosidase (LacA)

từ B. subtilis VTCC-DVN-12-01.

- Tìm được LacA đột biến có tính chất mới so với enzyme ban đầu.

3. Nội dung nghiên cứu

- Tạo đột biến ngẫu nhiên gen (lacA) mã hóa -galactosidase từ

B. subtilis VTCC DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA (error prone rolling circle

amplification, sao chép lỗi DNA vòng) và sàng lọc các dòng mang gen lacA đột

biến có hoạt tính tăng hoặc có các tính chất mới như nhiệt độ hoạt động, độ bền

nhiệt độ so với LacA ban đầu.

- Sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc protein/enzyme, kết hợp với so sánh

trình tự axit amin với các -galactosidase trong cùng họ đã được xác định cấu trúc

để dự đoán một số axit amin quan trọng tham gia trực tiếp trong quá trình thủy phân

cơ chất của LacA để từ đó tạo đột biến điểm định hướng nhằm tạo ra các LacA có

các tính chất mới so với enzyme ban đầu.