Nghiên cứu tính đa hình đơn các gene EBNA-1, EBNA-2 của Epstein-Bar virus trên bệnh nhân ung thư vòm họng Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH ĐƠN

CÁC GENE EBNA-1, EBNA-2 CỦA EPSTEIN-BARR VIRUS

TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG VIỆT NAM

Mã số đề tài: E2018-03-1

Chủ nhiệm đề tài: TS. Lao Đức Thuận

TpHCM, tháng 12 năm 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH ĐƠN

CÁC GENE EBNA-1, EBNA-2 CỦA EPSTEIN-BARR VIRUS

TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG VIỆT NAM

Mã số đề tài: E2018-03-1

Xác nhận của tổ chức chủ trì

(ký, họ tên, đóng dấu)

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên)

TpHCM, tháng 12 năm 2020

1

MỤC LỤC

THÀNH VIÊN ĐỀ TÀI....................................................................................................... 4

DANH MỤC HÌNH............................................................................................................. 5

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... 7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................................... 8

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU (TIẾNG VIỆT) ................................................. 9

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU (TIẾNG ANH)................................................ 13

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 17

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................................ 18

1.1. Ung thư vòm họng ............................................................................................... 18

1.2. Tình hình UTVH trên thế giới và Việt Nam........................................................ 19

1.3. Nguyên nhân gây UTVH. .................................................................................... 19

1.4. Epstein-Barr virus và tính đa hình của họ gene EBNAs ...................................... 20

1.5. Tính đa hình họ gene EBNAs............................................................................... 21

1.5.1. Gene EBNA-1 và tính đa hình của gene EBNA-1.......................................... 21

1.5.2. Gene EBNA-2 và tính đa hình của gene EBNA-2.......................................... 23

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 26

2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 26

2.1.1. Chương trình tin sinh học.............................................................................. 26

2.1.2. Bộ mẫu nghiên cứu ....................................................................................... 26

2.1.3. Thiết bị hỗ trợ thực hiện nghiên cứu............................................................. 27

2.1.4. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .............................................................. 27

2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 28

2

2.2.1. Khảo sát Tin sinh học.................................................................................... 29

2.2.2. Khảo sát mồi cho gene mục tiêu ................................................................... 29

2.2.3. Xác định biến thể........................................................................................... 31

2.2.4. Quy trình thực nghiệm .................................................................................. 31

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ....................................................................... 35

3.1. Khảo sát dữ liệu ................................................................................................... 35

3.1.1. Hình thành cơ sở dữ liệu về các biến thể của gene EBNA-1......................... 35

3.1.2. Cơ sở dữ liệu về các biến thể của gene EBNA-2........................................... 39

3.1.3. Kết quả khảo sát cặp mồi khuếch đại gene Beta-actin ................................. 43

3.1.4. Kết quả khảo sát cặp mồi khuếch đại gene EBNA-1..................................... 43

3.1.5. Kết quả khảo sát cặp mồi khuếch đại gene EBNA-2..................................... 47

3.1.6. Chu trình nhiệt tham khảo............................................................................. 53

3.2. Kết quả thực nghiệm. ........................................................................................... 54

3.2.1. Kiểm tra độ tinh sạch. ................................................................................... 54

3.2.2. Khảo sát quy trình khuếch đại trình tự gene mục tiêu. ................................. 56

3.2.3. Tần số dương tính các kiểu đa hình của gene và biến thể mục tiêu.............. 65

3.3. Phân tích tính đa hình của gene EBNA-1............................................................. 66

3.3.1. Tỉ lệ đa hình gene EBNA-1............................................................................ 66

3.3.2. Xác định dạng biến thể của gene EBNA-1 .................................................... 68

3.3.3. Sự thay đổi của các amino acid khác ngoài aa 487....................................... 69

3.4. Phân tích tính đa hình của gene EBNA-2............................................................. 85

3.4.1. Tỉ lệ đa hình gene EBNA-2............................................................................ 85

3.4.2. Biến thể EBNA2-A (E2A) của gene EBNA-2............................................... 86

3.4.3. Biến thể EBNA2-C (E2C) của gene EBNA-2 ............................................... 92

3

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 96

4.1. Kết quả khảo sát dữ liệu....................................................................................... 96

4.2. Kết quả phân tích biến thể ................................................................................... 96

4.3. Đề nghị................................................................................................................. 97

SẢN PHẨM CÔNG BỐ - ĐÀO TẠO .............................................................................. 98

TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................100

4

THÀNH VIÊN ĐỀ TÀI

TS. Lao Đức Thuận

ThS. Trương Kim Phượng

ThS. Nguyễn Hoàng Anh Tuấn

ThS. Ngô Đông Kha

5

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vị trí khối u vòm họng

Hình 1.2. Cấu trúc và vị trí chức năng protein EBNA-1.

Hình 1.3. Cấu trúc và vị trí chức năng protein EBNA-2

Hình 3.1. Kết quả blast mồi EBNA1-IF-IR

Hình 3.2. Kết quả sắp giống cột cặp mồi trong và mồi ngoài gene EBNA-1

Hình 3.3. Vị trí bắt cặp của các mồi khuếch đại gene EBNA-1

Hình 3.4. Kết quả blast mồi EBNA2-I-IF-IR

Hình 3.5. Kết quả sắp giống cột cặp mồi trong và mồi ngoài đoạn I gene EBNA-2.

Hình 3.6. Kết quả sắp giống cột cặp mồi trong và mồi ngoài đoạn II gene EBNA-2.

Hình 3.7. Vị trí bắt cặp của các mồi khuếch đại gene EBNA-2

Hình 3.8. Chu trình nhiệt tham khảo cho quá trình PCR.

Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra sự hiện diện beta-actin

Hình 3.10. Kết quả điện di cặp mồi trong EBNA1 IF-IR

Hình 3.11. Kết quả tối ưu cặp mồi trong EBNA1 IF-IR

Hình 3.12. Kết quả điện di cặp mồi EBNA1-IF-IR trên mẫu lành

Hình 3.13. Kết quả điện di trình tự khuếch đại từ mồi trong EBNA1 IF-IR

Hình 3.14. Kết quả Blast trình tự khuếch đại từ mồi EBNA1 IF-IR

Hình 3.15. Kết quả điện di cặp mồi trong EBNA2-I-IF-IR

Hình 3.16. Kết quả điện di trình tự khuếch đại từ mồi trong EBNA2-I-IF-IR

Hình 3.17. Kết quả Blast trình tự khuếch đại từ mồi trong EBNA2-I-IF-IR

Hình 3.18. Kết quả điện di cặp mồi trong EBNA2-II-IF-IR

Hình 3.19. Kết quả điện di trình tự khuếch đại từ mồi trong EBNA2-II-IF-IR

Hình 3.20. Kết quả Blast trình tự khuếch đại từ mồi trong EBNA2-II-IF-IR

Hình 3.21. Kết quả điện di cặp mồi khuếch đại gene EBNA-2 trên mẫu lành.

Hình 3.22. Vị trí amino acid 487 trên các biến thể của gene EBNA-1

6

Hình 3.23. Vị trí aa 499 trên các biến thể

Hình 3.24. Vị trí aa 520 và 553 xuất hiện đột biến đồng nghĩa trên tất cả các biến thể.

Hình 3.25. Vị trí aa 524 và 594 trên các biến thể xuất hiện đột biến trái nghĩa

Hình 3.26. Vị trí aa thay đổi đặc trưng trên biến thể P-Ala.

Hình 3.27. Vị trí aa thay đổi trên biến thể P-Thr trên mẫu T39

Hình 3.28. Vị trí aa thay đổi trên biến thể P-Thr trên mẫu T39 (tiếp theo)

Hình 3.29. Vị ví thay đổi Nucleotide 584 (A). Vị trí chèn 9 Nu trên biến thể P-Thr (B)

Hình 3.30. Một số vị trí đặc trưng trên biến thể V-Val được dẫn chứng bằng mẫu T6

Hình 3.31. Vị trí thay đổi nucleotide riêng lẻ trên biến thể V-Val (1)

Hình 3.32. Vị trí thay đổi nucleotide riêng lẻ trên biến thể V-Val (2)

Hình 3.33. Vị trí aa thay đổi trên biến thể V-Leu

Hình 3.34. Vị trí amino aicd 487 trên mẫu mang thể dị hợp

Hình 3.35. Một số vị trí thay đổi của biến thể dị hợp trên mẫu T65.

Hình 3.36. Một vài vị trí cùng thay đổi trên nhóm biến thể E2A trên mẫu T3.

Hình 3.37. Các vị trí thay đổi đặt trưng trên nhóm Add-CTC trên mẫu T3

Hình 3.38. Các vị trí thay đổi đặt trưng của nhóm Del-51bp trên mẫu T30

Hình 3.39. Các vị trí khác thay đổi riêng lẻ trên biến thể E2A

Hình 3.40. Các vị trí khác thay đổi riêng lẻ khác trên biến thể E2A

Hình 3.41. Vị trí amino acid thay đổi trên biến thể E2C trên mẫu T7

Hình 3.42. Hai vị trí aa thay đổi riêng lẻ trên mẫu T44 và T83.

7

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Bảng mồi sử dụng trong nghiên cứu.

Bảng 3.1. Các biến thể biến thể gene EBNA-1 và vị trí trình tự amino acid 487

Bảng 3.2. Một vài vị trí aa trên các biến thể của EBNA-1 tham khảo từ các nghiên cứu

Bảng 3.3. Các biến thể biến thể gene EBNA-2

Bảng 3.4. Một vài vị trí aa thay đổi trên các biến thể của gene EBNA-2

Bảng 3.5. Thông số vật lý cặp mồi khuếch đại trình tự gene EBNA-1

Bảng 3.6. Thông số vật lý cặp mồi khuếch đại trình tự gene EBNA-1

Bảng 3.7. Thông số vật lý cặp mồi khuếch đại trình tự gene EBNA-2

Bảng 3.8. Thông tin nhiệt độ và thời gian của các cặp mồi.

Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của mẫu nghiên cứu

Bảng 3.10. Bảng kí hiệu vùng khuếch đại và kích thước sản phẩm của mồi EBNA2

Bảng 3.11. Tỉ lệ các loại đa hình của gene EBNA-1 và EBNA-2

Bảng 3.12. Vị trí thay đổi Nuclotide trên các biến thể của gene EBNA-1

Bảng 3.13. Vị trí thay đổi Nucleotide trên các aa của biến thể P-Ala

Bảng 3.14 Vị trí thay đổi Nucleotide trên các aa của biến thể P-Thr

Bảng 3.15. Vị trí thay đổi Nucleotide trên các aa của biến thể V-Val

Bảng 3.16. Vị trí thay đổi Nucleotide trên các aa của biến thể V-Leu

Bảng 3.17. Vị trí thay đổi Nucleotide trên các aa của biến thể dị hợp

Bảng 3.18. Một vài vị trí thay đổi Nuclotide trên các biến thể của gene EBNA-2

Bảng 3.19. Vị trí thay đổi cùng xuất hiện trên biến thể E2A

Bảng 3.20. Vị trí thay đổi nucleotide cùng xuất hiện đặc trưng cho 2 nhóm biến thể

Bảng 3.21. Một vài thay đổi riêng lẻ được ghi nhận trên biến thể E2A

Bảng 3.22. Vị trí thay đổi trên biến thể E2-C

8

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

aa: amino acid

EBNA-1: Epstein–Barr nuclear antigen 1

EBNA-2: Epstein–Barr nuclear antigen 2

EBV: Epstein–Barr virus

UTVH: Ung thư vòm họng