Nghiên cứu tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường trên đối tượng cây Xoan ta (Melia azedazach L.) bằng công nghệ gen thực vật

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÙI VĂN THẮNG

NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU CÁC ĐIỀU KIỆN

BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÂY XOAN TA

(Melia azedarach L.) BẰNG CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2014

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÙI VĂN THẮNG

NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU CÁC ĐIỀU KIỆN

BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÂY XOAN TA

(Melia azedarach L.) BẰNG CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Chu Hoàng Hà

2. TS. Lê Văn Sơn

Hà Nội, 2014

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Biến đổi khí hậu ngày càng diễn ra mạnh mẽ là nguyên nhân làm tăng những

bất lợi từ môi trƣờng, ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nhiều loài cây

trồng. Do sự thay đổi khí quyển với hiệu ứng nhà kính, nhiệt độ của khí quyển ấm

dần lên, băng tan ở hai cực sẽ tạo sự ngập lụt ở các vùng đất thấp. Lũ lụt, hạn hán và

sự xâm nhập mặn sẽ trở thành vấn đề lớn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến phát triển

nông lâm nghiệp. Để thích ứng với những biến đổi khí hậu và những hệ quả của

chúng, chiến lƣợc chung của ngành nông lâm nghiệp là ƣu tiên tạo ra những giống

cây trồng chống chịu đƣợc khô hạn, mặn, ngập úng, lạnh và chống chịu với đất có

vấn đề nhƣ acid, thiếu lân, ngộ độc sắt, ngộ độc nhôm.

Những tác động bất lợi từ môi trƣờng nhƣ khô hạn, đất nhiễm mặn, ngập

úng, nhiệt độ cực đoan thƣờng làm mất cân bằng về áp suất thẩm thấu gây ảnh

hƣởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng của nhiều loài cây trồng (Linhui

et al., 2012). Một trong những phản ứng thƣờng gặp nhất khi cây gặp các điều kiện

bất lợi về nƣớc đó là tăng cƣờng tổng hợp và tích lũy các chất chuyển hóa nhƣ các

loại đƣờng tan, axít amin, v.v. để tăng cƣờng áp suất thẩm thấu cho tế bào. Proline

và glycine betaine đƣợc biết đến là một trong những chất đóng vài trò quan trọng

trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các

điều kiện bất lợi nhƣ khô hạn, mặn, lạnh (Sávio et al., 2012). Trong tế bào thực vật,

glycine betaine (GB) đƣợc tổng hợp từ choline thông qua hai phản ứng liên tiếp

đƣợc xúc tác bởi choline monooxygenase (CMO) và betain aldehyde

dehydrogenase (BADH) (Rathinasbapathi et al., 1997). Cũng giống nhƣ thực vật

bậc cao, ở vi khuẩn E. coli và ở một số động vật, con đƣờng sinh tổng hợp GB cũng

trải qua hai bƣớc là khử choline thành betaine aldehyde và oxy hóa betaine

aldehyde thành GB (Takabe et al., 1998). Ngƣợc lại, con đƣờng sinh tổng hợp GB ở

vi khuẩn Arthrobacter globiformis và Arthrobacter panescens lại rất đơn giản, từ

choline chuyển hóa thành sản phẩm trực tiếp là GB chỉ cần xúc tác bởi choline

oxydase (COD) (Ikuta et al., 1977). Sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao có thể

đƣợc thực hiện qua hai con đƣờng hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine. Con đƣờng

sinh tổng hợp proline từ glutamate đƣợc chứng minh đầu tiên ở vi khuẩn bởi

Leisinger (Leisinger, 1987) và sau đó là ở nhiều loài sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn

2

khác nhau. Ở thực vật bậc cao, chu trình này chỉ đƣợc xác định sau khi các nhà

khoa học thành công trong việc phân lập đƣợc đoạn cDNA của gen mã hóa cho

enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) (Hu et al., 1992). P5CS là một

enzyme giữ hai chức năng, thứ nhất enzyme hoạt hóa glutamate trở thành dạng hoạt

động là glutamic semialdehyde và sau đó xúc tác cho phản ứng đóng vòng để tạo ra

pyrroline-5-carboxylate. Dẫn xuất này sau đó sẽ bị khử bằng phản ứng xúc tác bởi

enzyme pyrroline-5-carboxylate reductase để tạo proline.

Từ những hiểu biết sâu sắc về con đƣờng sinh tổng hợp glycine betaine và

proline ở sinh vật, cùng với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc

biệt là kỹ thuật tạo cây trồng biến đổi gen. Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc các

gen: codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT, SDMT, P5CS và P5CR

từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng

hợp GB và proline. Các gen này đã đƣợc thiết kế với các promoter biểu hiện đặc

hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng, các loài cây trồng biến

đổi gen tăng cƣờng khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trƣờng (Amudha

& Balasubramani, 2011). Các kết quả công bố cho thấy : Cây Arabidopsis thaliana

chuyển gen codA,COX, GSMT/SDMT tăng cƣờng khả năng chiụ laṇ h , nhiêṭ đô ̣cao,

chịu măṇ và băng giá (Ali et al., 1998a, 1998b; Hayashi et al., 1997, 1998;

Sakamoto et al., 2000; Huang et al., 2000), cây cải be ̣(Brassica juncea) chuyển gen

codA có khả năng chiụ măṇ tốt hơn cây đối chƣ́ng (Waditee et al., 2005). Tƣơng tự,

cây lúa (Oriza sativa) chuyển gen codA, betA,COX, CMO, cây cà chua, cây hồng,

cây bạch đàn chuyển gen codA cũng tăng cƣờng kh ả năng chiụ laṇ h , hạn, măṇ và

oxy hóa (Sakamoto et al., 1998, Takabe et al., 1998; Su et al., 2006; Shirasawa et

al., 2006; Mohanty et al., 2002; Park et al., 2004, 2007a; Yu et al., 2009). Cây thuốc

lá chuyển gen COX, betA, CMO, BADH (Lilius et al., 1996; Nuccio et al., 1998;

Yang et al., 2008), cây cà rốt chuyển gen BADH (Kumar et al., 2004); cây bông và

ngô chuyển gen betA (Lv et al., 2007; Quan et al., 2004a, 2004b) cũng đã đƣợc

chứng minh là chống chịu tốt hơn với các điều kiện cực đoan của môi trƣờng. Kết

quả nghiên cứu chuyển gen P5CS, P5CR,  -OAT tham gia sinh tổng hợp proline

vào cây thuốc lá, lúa nƣớc, lúa mì, cà rốt, chanh, đậu tƣơng, Arabidopsis cho thấy

cây chuyển gen chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trƣờng sống bị mặn, hạn, oxy

hóa, nhiệt cao và băng giá (Kavi Kishor et al., 1995; Zhu et al., 1998; Hong et al.,

3

2000; Anoop et al., 2003; Su & Wu, 2004; Sawahel & Hassan, 2002; Han &

Hwang, 2003; Hur et al., 2004; Molinari et al., 2004; De Ronde et al., 2004).

Việt Nam là một trong những quốc gia bị tác động mạnh mẽ của việc biến

đổi khí hậu, do đó hạn hán và đất nhiễm mặn hoang hóa đang ngày một gia tăng,

đây sẽ là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lƣợng cây

trồng nông lâm nghiệp và thu hẹp diện tích đất canh tác. Vì vậy, viêc̣ triển khai các

nghiên cƣ́u nhằm taọ ra đƣơc̣ các giống cây trồng nông lâm nghiệp có khả năng

chống chiụ đƣơc̣ các điều kiêṇ bất lơị của môi trƣờng nhƣng vâñ đảm bảo đƣơc̣

năng suất và chất lƣơṇ g tốt đang là vấn đề cấp bách và cần thiết nhất hiêṇ nay. Trên

thế giới, các nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng chống chịu các điều

kiện môi trƣờng bất lợi chủ yếu tập chung vào nhóm cây nông nghiệp, còn nhóm

cây lâm nghiệp (cây gỗ) mới chỉ có một vài công trình công bố (Yu et al., 2009, Yu

et al., 2010). Trong lâm nghiệp, cây dƣơng (Populus sp.) đƣợc sử dụng nhƣ là cây

mô hình cho các nghiên cứu chuyển gen. Tuy nhiên, hạn chế duy nhất của loài cây

này đó là khó sinh trƣởng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam. Vì vậy, việc tìm

kiếm một loài cây dễ thích ứng và phổ biến ở Việt Nam để làm cây mô hình cho các

nghiên cứu theo hƣớng quan tâm trên đối tƣợng cây lâm nghiệp trở nên rất cần thiết.

Cây Xoan ta đƣợc đánh giá là một trong những cây trồng quan trọng trong chiến

lƣợc phát triển lâm nghiệp ở nƣớc ta. Nó có mặt ở 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp,

trong đó 3 vùng: Vùng Trung tâm, vùng Đồng bằng Sông Hồng và vùng Nam

Trung bộ Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây trồng đƣợc ƣu tiên phát triển

theo quyết định số 16/2005/QĐ-BNN ngày 15/03/2005 của Bộ trƣởng Bộ

NN&PTNT. Hơn nữa, những kết quả nghiên cứu bƣớc đầu trong việc xây dựng

phƣơng pháp chuyển gen ở đối tƣợng cây Xoan ta là rất có triển vọng (Bui Van

Thang et al., 2007a; Nirsatmanto & Gyokusen, 2007; Ngo Van Thanh et al., 2010)

cho phép các nhà khoa học có thể tiến hành các nghiên cứu cải thiện giống, đặc biệt

là nâng cao tính chống chịu của loài cây này và có thể sử dụng nhƣ một loài cây mô

hình cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây lâm nghiệp ở Việt Nam. Xuất phá

t tƣ̀

nhƣ̃ng lý do nêu trên, chúng tôi đã tiến hành thƣc̣ hiêṇ đề tà

i “Nghiên cứu tăng

cƣờng khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng trên đối

tƣợng cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng công nghệ gen thực vật”.

4

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

2.1. Mục tiêu chung:

Thông qua công nghệ chuyển gen để nghiên cứu khả năng tăng cƣờng tính

chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi trên đối tƣợng cây Xoan ta nhằm bổ

sung thêm cơ sở khoa học và thực tiễn cho việc tạo giống cây trồng lâm nghiệp có

khả năng chống chịu tốt với điều kiện môi trƣờng bất lợi.

2.2. Mục tiêu cụ thể:

(1) Xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta đạt hiệu suất cao để làm

công cụ nghiên cứu;

(2) Đánh giá đƣợc hoạt động của promoter rd29A cảm ứng hạn ở các dòng Xoan ta

chuyển gen;

(3) Đánh giá đƣợc khả năng chịu hạn của các dòng Xoan ta chuyển gen P5CS đột

biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngƣợc (P5CSm);

(4) Đánh giá đƣợc khả năng chịu hạn, mặn của các dòng thuốc lá và Xoan ta chuyển

gen codA.

3. Nội dung nghiên cứu

(1) Xây dựng và tối ƣu hóa quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta thông qua

Agrobacterium tumefaciens;

(2) Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen rd29A::gus intron và đánh

giá hoạt động của promoter rd29A điều khiển biểu hiện gen gus trong điều kiện bình

thƣờng và xử lý hạn nhân tạo;

(3) Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen rd29A:: P5CSm và đánh

giá kiểu hình, đặc tính sinh lý, sinh hóa của cây chuyển gen trong điều kiện xử lý

hạn nhân tạo;

5

(4) Tạo các dòng thuốc lá và Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen 35S::TP￾codA/35S::codA và đánh giá kiểu hình, đặc tính sinh lý, sinh hóa của cây chuyển

gen trong điều kiện xử lý hạn, mặn nhân tạo.

4. Đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới xây dựng

đƣợc quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta đạt hiệu suất cao thông qua

Agrobacterium tumefaciens. Luận án là công trình đầu tiên tạo đƣợc các dòng cây

Xoan ta chuyển gen P5CSm/codA và chứng minh đƣợc khả năng tăng cƣờng tính

chịu hạn và chịu mặn ở các dòng cây chuyển gen. Luận án cũng là công trình đầu

tiên sử dụng gen codA đã đƣợc thích ứng mã di truyền ở thực vật để chuyển vào cây

thuốc lá và cây Xoan ta, kết quả cho thấy cây chuyển gen sinh tổng hợp và tích lũy

hàm lƣợng glycine betaine cao hơn rất nhiều lần so với các công trình công bố trƣớc

đây. Luận án đã góp phần bổ sung thêm cơ sở lý luận và thực tiễn cho việc ứng

dụng công nghệ chuyển gen trong tạo giống cây trồng nông lâm nghiệp nói chung

và cây Xoan ta nói riêng chống chịu tốt với các điều kiện môi trƣờng bất lợi.

6

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÁC ĐỘNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG BẤT LỢI ĐẾN CÂY TRỒNG

Thực vật có đặc điểm về trạng thái sống đặc thù, đó là bám trụ vào đất tại

một chỗ, không di chuyển từ nơi sống này đến nơi sống khác trong suốt quá trình

phát triển. Do đó, khác với động vật, thực vật thƣờng xuyên đối mặt trực tiếp với

các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tác động lên quá trình sinh trƣởng và phát triển.

Những tác động bất lợi từ môi trƣờng có thể gây ra những biến đổi sinh lý, hóa sinh

và hình thái; từ đó ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng cây trồng.

1.1.1. Tác hại của hạn đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng

Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lƣợng

sản phẩm của cây trồng. Khi môi trƣờng hạn hán cây bị stress mất nƣớc dẫn đến

nhiều hậu quả nghiêm trọng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013): (i)

Gây nên hiện tƣợng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo. Sự co nguyên sinh chất

xảy ra khi tế bào bị stress nƣớc làm cho nƣớc trong tế bào thất thoát ra ngoài nên

khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp. Khi cây sống

trong môi trƣờng thiếu nƣớc kéo dài, tế bào mất nƣớc dẫn đến các mô trở nên mềm

yếu và sự héo xảy ra. Mô thực vật bị héo tạm thời nhƣng cũng có thể vĩnh viễn nếu

sự thiếu nƣớc xảy ra nghiêm trọng và trong thời gian dài. (ii) Môi trƣờng sống bị

khô hạn cản trở sự vận chuyển nƣớc trong mạch gỗ. Khi thiếu nƣớc do khô hạn sự

cung cấp nƣớc cho rễ không đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nƣớc ban

ngày, dẫn đến các lông hút bị tổn thƣơng lớp ngoài vùng vỏ bị phủ chất sáp

(suberin) làm giảm áp suất rễ nên ảnh hƣởng đến đẩy cột nƣớc lên cao trong mạch

gỗ. Đặc biệt khi thiếu nƣớc sẽ hình thành nhiều bọt khí trong mạch gỗ dẫn đến phá

vỡ tính liên tục của cột nƣớc nên cột nƣớc trong mạch gỗ không đƣợc đẩy lên liên

tục. (iii) Hạn hán làm dày lớp cutin trên bề mặt lá làm giảm sự thoát hơi nƣớc qua

biểu bì. (iv) Sự thiếu nƣớc làm giảm cƣờng độ quang hợp. Khi hàm lƣợng nƣớc

7

trong lá còn khoảng 40 -50% quang hợp của lá bị đình trệ. (v) Đặc biệt, hạn hán cản

trở sự sinh trƣởng của cây trồng. Thiếu nƣớc ảnh hƣởng đến các hoạt động sinh lý,

nhất là quang hợp nên làm giảm sinh trƣởng và năng suất cây trồng nghiêm trọng.

1.1.2. Tác hại của đất nhiễm mặn đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng

Đất mặn là loại đất chứa hàm lƣợng muối cao (>0,2%) có nhiều ion độc. Nếu

hàm lƣợng muối trong đất cao, áp suất thẩm thấu của dung dịch đất rất cao, có thể

đạt 200 - 300 atm. Do đất nhiễm mặn có áp suất thẩm thấu cao nên cây không thể

hút đƣợc nƣớc từ môi trƣờng gây nên hiện tƣợng hạn sinh lý. Cây bình thƣờng

không thể sống trong môi trƣờng có áp suất thẩm thấu trên 40 atm. Ngoài ra, trong

đất nhiễm mặn còn chứa nhiều ion độc. Các ion này cạnh tranh với chất dinh dƣỡng

trong quá trình hút của rễ làm cho rễ khó hút chất dinh dƣỡng dẫn đến cây trồng

sinh trƣởng chậm và giảm năng suất mạnh. Trong đất nhiễm mặn có các muối

NaCl, Na2SO2, Na2SO4, Na2CO3, MgCl2,, v.v. các muối này có hàm lƣợng cao trong

đất đều gây độc cho cây. Khi cây hút các ion độc vào trong tế bào sẽ gây ra rối loạn

các quá trình trao đổi chất của tế bào. Các ion độc sẽ ức chế hoạt động của các

enzyme, các chất điều hòa sinh trƣởng dẫn đến làm rối loạn các quá trình trao đổi

chất và các hoạt động sinh lý bình thƣờng của tế bào. Các ion độc còn làm ảnh

hƣởng bất lợi đến nguyên sinh chất, làm giảm mạnh độ nhớt, tính thấm của nguyên

sinh chất làm cho tế bào mất chất dinh dƣỡng. Các hoạt động sinh lý của tế bào

cũng bị ảnh hƣởng nghiêm trọng khi cây bị tác động của muối mặn. Quá trình

quang hợp giảm mạnh do lá kém phát triển, sắc tố quang hợp ít do các chất độc ức

chế quá trình tổng hợp các sắc tố quang hợp. Quá trình hô hấp tăng mạnh, các cơ

chất bị phân hủy mạnh nhƣng hiệu quả tạo năng lƣợng thấp do phần lớn năng lƣợng

của các quá trình dị hóa bị thải ra dƣới dạng nhiệt làm cho tế bào thiếu năng lƣợng

ATP để duy trì các hoạt động bình thƣờng. Phân hủy mạnh, tổng hợp lại yếu nên

không bù đủ lƣợng vật chất do hô hấp phân hủy, dẫn đến các chất dự trữ bị hao hụt

mạnh, do đó cây không sinh trƣởng hoặc sinh trƣởng chậm, còi cọc và năng suất

8

thấp. Cây sẽ bị chết nếu bị tác động của môi trƣờng nhiễm mặn cao hay nhiễm mặn

trong thời gian dài (Jouyban, 2012).

1.1.3. Tác hại của nhiệt độ cao đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng

Thực vật là sinh vật biến nhiệt nên nhiệt độ môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đến

hoạt động sống của cây. Biên độ nhiệt độ sinh lý của cây khoảng 1 – 45oC. Stress

nhiệt do nhiệt độ môi trƣờng xung quanh cao là một mối đe dọa nghiêm trọng đối

với cây trồng sản xuất trên toàn thế giới (Hall, 2001; Harrison et al., 2011). Nhiệt độ

cao gián đoạn hoặc liên tục là nguyên nhân gây ra một loạt thay đổi về hình thái giải

phẫu, sinh lý và sinh hóa ở thực vật, ảnh hƣởng đến sự tăng trƣởng và phát triển của

thực vật và có thể dẫn đến suy giảm sản lƣợng.

Sự tiếp xúc của thực vật tới nhiệt độ cao, hạt giống có thể đẩy nhanh quá trình

lão hóa, làm giảm sự đậu quả, trọng lƣợng hạt giống và làm giảm năng suất. Điều

này là do thực vật có xu hƣớng chuyển hƣớng các nguồn năng lƣợng để chống lại

stress do nhiệt và do đó hạn chế sinh trƣởng và sinh sản. Một ảnh hƣởng khác của

stress do nhiệt cao cho nhiều loài thực vật là gây ra vô sinh khi nhiệt cao tác dụng

ngay trƣớc hoặc trong khi nở hoa. Cây họ đậu đặc biệt nhạy cảm với stress do nhiệt

ở giai đoạn nở hoa, chỉ có một vài ngày tiếp xúc với nhiệt độ cao (30 – 35oC) có thể

gây ra tổn thất nặng cho năng suất thông qua giảm lƣợng hoa hoặc tình trạng không

phát triển đầy đủ của vỏ quả. Ở nhiệt độ rất cao gây tổn thƣơng tế bào nghiêm trọng

và thậm chí làm cho tế bào bị chết trong vòng vài phút, dẫn đến sự sụp đổ nhanh

chóng của các tổ chức tế bào (Schoffl et al., 1999). Ở nhiệt độ cao vừa phải, tổn

thƣơng hoặc chết chỉ có thể xảy ra sau khi tiếp xúc lâu dài. Tổn thƣơng trực tiếp do

nhiệt độ cao bao gồm sự biến tính protein và sự kết tụ, tăng tính lƣu động của màng

lipid. Tổn thƣơng gián tiếp hoặc tổn thƣơng nhiệt chậm hơn bao gồm bất hoạt các

enzyme trong lục lạp và ty thể, ức chế tổng hợp protein, suy thoái protein và màng

tế bào mất tính linh hoạt (Howarth, 2005).

9

Stress nhiệt cao cũng ảnh hƣởng đến tổ chức của các cấu trúc vi ống bằng

cách chia tách và/hoặc kéo dài của chúng, hình thành các thể sao hình ống trong các

tế bào phân bào và kéo dài của vi ống hạt vách. Tổn thƣơng này cuối cùng dẫn tới

ức chế sự tăng trƣởng, giảm dòng ion, tạo ra hợp chất độc hại và các loại ôxy phản

ứng (reactive oxygen species = ROS) gây độc cho tế bào (Howarth, 2005).

Sinh trƣởng của cây trồng giảm sút là kết quả chính của việc cây sinh trƣởng

trong điều kiện nhiệt độ cao. Nguyên nhân chủ yếu là do nhiệt độ cao làm giảm

năng suất quang hợp, năng lƣợng tạo ra giảm sút nghiêm trọng. Có giả thiết cho

rằng trong các phản ứng của pha sáng, nhiệt độ của lá tăng lên do việc tổng hợp

ATP liên tục (bằng quá trình vận chuyển điện tử có tính chu trình) cho đến khi cân

bằng với lƣợng ATP tiêu thụ (Bukhov et al., 1999). Trong các phản ứng pha tối của

quá trình quang hợp, sự hoạt hóa Rubisco trong chu trình Calvin đã đƣợc xác định

nhƣ là bƣớc trung gian, sự hoạt hóa này bị ức chế ở 35–40◦C dẫn đến việc giảm tiêu

thụ CO2 và giảm tạo ra các carbohydrates (Dubey, 2005; Wahid et al., 2007). Trong

ty thể, điều kiện bất lợi thông thƣờng sẽ là nguyên nhân phá hủy NAD+, ATP tiêu

thụ vƣợt trội và việc hô hấp sẽ tăng lên. Việc phá vỡ NAD+ một phần do nguyên

nhân của việc tăng cƣờng hoạt động của poly(ADP-ribose) polymerase (PARP),

chất sử dụng NAD+ nhƣ là cơ chất để tổng hợp ADP-ribose. Quá trình poly(ADP)

ribosyl hóa này là quá trình điều hòa sau dịch mã của các protein nhân, là bƣớc

đƣợc khởi đầu bởi sự oxi hóa và các dạng khác của việc phá hỏng DNA. Sự suy yếu

gây ra bởi điều kiện bất lợi mang lại sự suy yếu của năng lƣợng khi mà các phân tử

ATP đòi hỏi để tái tổng hợp NAD+ (Zidenga, 2005). Cuối cùng, có thể nói rằng

việc chống chịu nhiệt độ của cây là một quá trình tiêu tốn nhiều năng lƣợng nội bào

đáng kể để đối phó nhiệt độ cao. Nói chung các phản ứng đó làm suy yếu năng

lƣợng và tăng cƣờng sản xuất ROS, rốt cuộc có thể gây chết tế bào, mô và cả cơ thể

(De Block et al., 2005).

10

1.1.4. Tác hại của nhiệt độ thấp đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng

Nhiệt độ thấp làm cho lá cây bị héo mặc dù môi trƣờng vẫn đủ nƣớc do nhiệt

độ thấp ức chế sự hút nƣớc của hệ rễ và sự vận chuyển nƣớc của hệ mạch. Nhiệt độ

thấp cũng gây ức chế quá trình quang hợp của lá, làm giảm hô hấp, ức chế các quá

trình tổng hợp nhất là tổng hợp các phân tử protein do các enzyme hoạt động yếu. Ở

nhiệt độ thấp làm cho màng nguyên sinh chất bị tổn thƣơng dẫn đến tăng tính ngoại

thấm nên thất thoát chất dinh dƣỡng của tế bào ra bên ngoài. Nhiệt độ thấp ảnh

hƣởng đến cấu trúc và chức năng của hệ rễ. Sự hút nƣớc và chất khoáng bị giảm

mạnh làm cho cây thiếu nƣớc và chất dinh dƣỡng. Nhiệt độ thấp còn làm tổn hại

màng lục lạp, ty thể dẫn đến ảnh hƣởng nghiêm trọng đến các quá trình sinh lý của

cây nhƣ quá trình quang hợp, hô hấp. Nói chung nhiệt độ thấp làm giảm mạnh sinh

trƣởng, năng suất và chất lƣợng sản phẩm của cây trồng (Gulzar et al., 2011).

1.1.5. Phản ứng của thực vật đối với các điều kiện môi trƣờng bất lợi

Các yếu tố cực đoan nhƣ nhiệt độ cao, băng giá, ánh sáng, oxy hóa,v.v.

thƣờng tác động lên lá. Hạn, úng và mặn muối thƣờng tác động lên bộ rễ. Các yếu

tố cực đoan thƣờng gây ra diện rộng về các phản ứng của thực vật, từ việc thay đổi

biểu hiện gen, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến

tốc độ sinh trƣởng và năng suất cây trồng. Những biến đổi lớn liên quan đến mức độ

sinh trƣởng và trao đổi chất khi gặp các yếu tố cực đoan của môi trƣờng sẽ làm thay

đổi sự biểu hiện của gen. Điều đó bắt đầu từ việc nhận biết tín hiệu ở mức độ tế bào,

lan truyền tín hiệu này trong tế bào và tiếp sau đó lan truyền khắp cơ thể sinh vật.

Sự biểu hiện của các gen phản ứng đối với các yếu tố cực đoan thể hiện đầu tiên là

ở mức độ tế bào, sau đó đến mức độ toàn bộ cơ thể, tiếp theo là sự thay đổi về hình

thái, sinh trƣởng, phát triển và cuối cùng làm ảnh hƣởng đến khả năng tạo năng suất

và chất lƣợng sản phẩm của cây trồng (Trần Thị Phƣơng Liên, 2010).

Sự biểu hiện các gen phản ứng với các yếu tố cực đoan của môi trƣờng phụ

thuộc vào khả năng nhận biết chúng. Bằng chứng là tăng cƣờng các chất điều khiển

11

những phản ứng của cây trồng đối với các yếu tố cực đoan nhƣ xuất hiện abscisic

acid (ABA), jasmonic acid (JA), ethylene, sau đó xuất hiện các phản ứng thứ cấp

nhƣ xuất hiện Ca2+ (Shinozaki et al., 2007). Mức độ biểu hiện của một số gen tăng

hẳn lên, một số khác yếu hẳn đi. Điều hòa việc biểu hiện các gen này khi gặp các

yếu tố cực đoan của môi trƣờng đã và đang đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm

nghiên cứu ở các giai đoạn khác nhau: trƣớc khi phiên mã, sau phiên mã, dịch mã,

sau dịch mã và từng bƣớc làm sáng tỏ dần cơ chế phân tử liên quan đến tích chống

chịu các điều kiện cực đoạn của thực vật. Nhƣ vậy, khi gặp các yếu tố cực đoan đột

ngột, thực vật phải điều chỉnh để thích ứng với sự thay đổi môi trƣờng sống nhằm

kéo dài khả năng tồn tại, sinh trƣởng và phát triển. Phản ứng của thực vật khi gặp

điều kiện nhƣ hạn, mặn, v.v. gây mất nƣớc tế bào, chúng thƣờng tăng cƣờng biểu

hiện các gen liên quan đến tổng hợp các chất thứ cấp nhƣ các loại đƣờng tan,

proline, glycine betaine, v.v. để tăng cƣờng áp suất thẩm thấu của tế bào (Khan et

al., 2009; Szabados & Savoure´, 2009) hoặc biểu hiện các gen mã hóa cho các

protein chịu hạn, mặn nhƣ protein LEA (Porcel et al., 2005). Đối với hiện tƣợng

nhiệt độ cao, chúng sẽ tăng cƣờng mức độ biểu hiện các gen mã hóa cho các protein

sốc nhiệt (Hsp – heat shock protein) (Simões-Araújo et al., 2003).

Thời gian, mức độ khốc liệt của các yếu tố cực đoan ảnh hƣởng khác nhau đến

khả năng phản ứng của cây trồng. Hiện tƣợng mất nƣớc cục bộ chỉ gây thiệt hại cho

một nhóm nhỏ, nhƣng hạn hán, nhiễm mặn kéo dài sẽ gây thiệt hại cho nhiều loài cây

trồng trên một vùng rộng lớn, ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng sản phẩm cây

trồng (Trần Thị Phƣơng Liên, 2010). Ngoài ra, các cơ quan, các mô tế bào khác nhau

sẽ phản ứng với các yếu tố cực đoan không giống nhau. Các loài thực vật khác nhau

sẽ có khả năng chống chịu khác nhau với các yếu tố cực đoan của môi trƣờng phụ

thuộc vào bản chất di truyền (hệ gen) của chúng. Vì vậy, khi đối mặt trực tiếp với các

yếu tố bất lợi của môi trƣờng có loài cây có thể chống chịu đƣợc để tồn tại, sinh

trƣởng và phát triển, có loài cây sẽ bị chết. Ngay trong cùng một loài cây, các cá thể

khác nhau cũng có mức độ phản ứng khác nhau với yếu tố cực đoan của môi trƣờng

(Buchanan et al., 2000).

12

1.2. TÍNH CHỐNG CHỊU VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG BẤT LỢI CỦA

THỰC VẬT

1.2.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi

Điều kiện bất lợi từ môi trƣờng sống - stress (điều kiện bất lợi phi sinh học

nhƣ mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao, băng giá, v.v.) dẫn đến hàng loạt các thay đổi về

hình thái, tính chất vật lý, hóa sinh, phân tử, điều đó ảnh hƣởng xấu đến sự sinh

trƣởng và phát triển của thực vật. Để đảm bảo tính toàn vẹn và sống còn, nhiều loài

thực vật có các chiến lƣợc đối phó với những bất lợi phi sinh học khác nhau. Sự

phản ứng của cơ thể sống với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào từng loài, kiểu

gen, thời gian tác động và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi và giai đoạn

phát triển, dạng đặc thù của các cơ quan hoặc tế bào và phần ngoại vi của chúng.

Khi bị tác động bởi các yếu tố bất lợi của môi trƣờng, thực vật sẽ tạo ra một số chất

kích thích, protein giải độc hoặc hoormon giúp chúng có khả năng thích ứng.

Hiện nay, các nghiên cứu về cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi từ môi

trƣờng ở thực vật đang đƣợc tập trung vào hƣớng nghiên cứu làm tăng cƣờng các

chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự mất cân bằng về nƣớc. Sự

tăng cƣờng các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu đƣợc phát hiện trong nhiều

trƣờng hợp môi trƣờng bất lợi nhƣ hạn hán, muối mặn và lạnh giá (Khan et al.,

2009; Szabados & Savoure´, 2009). Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một

đặc tính rất quan trọng của tế bào khi bị mất nƣớc do lạnh, muối hoặc hạn. Những

thực vật sống trong môi trƣờng thiếu nƣớc bị mất cân bằng về áp suất thẩm thấu

trong tế bào đòi hỏi phải có khả năng chống chịu lại điều kiện khắc nghiệt đó.

Một trong những phƣơng thức của thực vật chống lại sự mất cân bằng về áp

suất thẩm thấu đó là dựa trên sự thay đổi trong chuyển hóa tế bào chất dẫn đến sự

xuất hiện và tích lũy các chất hòa tan tƣơng tích, protein hoặc các axít amin đặc

hiệu (Ashraf et al., 2009). Hiện tƣợng này xảy ra rất nhanh khi tế bào bị mất nƣớc.

Sự tích lũy các chất này không làm ảnh hƣởng đến hoạt động bình thƣờng của các

enzyme nội bào. Ngƣợc lại, sự tích lũy lƣợng lớn các chất hòa tan trong tế bào sẽ

điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng tác động tổng thể mà chúng có khả năng giữ và

lấy nƣớc vào tế bào. Ngoài ra, chúng có thể thay thế vị trí nƣớc nơi xảy ra các phản

ứng hóa sinh, tƣơng tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy

màng tế bào và các phức hệ protein. Về mặt hóa học, chúng thƣờng là những phân