Nghiên cứu tăng cường khả năng chịu mặn bằng chuyển ghen Coda trên mô hình cây xoan ta ( Melia Azedarach L.)

i

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ HIỀN

NGHIÊN CƢ́ U TĂNG CƢỜ NG KHẢ NĂNG CHỊU MẶ N

BẰ NG CHUYỂN GEN CODA TRÊN MÔ HÌNH CÂY XOAN TA

(MELIA AZEDARACH L.)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

ii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cƣ́u trong luận văn là trung thƣ̣ c

và chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hiền

iii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Để hoànthành luận văn này, tôi xin trân trọ ng cảm ơn PGS. TS. Chu Hoàng Hà–

Phó Viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học, Trƣở ng phòng Công nghệ tế bào thƣ̣ c vật–

Viện Công nghệ Sinh họ c– Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đã tận tình hƣớng

dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôirtong suốt quá trình thực hiện và hoàn chỉnh luận văn.

Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể cán bộ phòng

Công nghệ Tế bào thƣ̣ c vật – Viện công nghệ sinh họ c , đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý

và động viên tôi trong thời gian thực tập tại phòng.

Tôi cũng xin đƣợ c trân trọ ng cảm ơn Ths Bùi Văn Thắng -Trƣờng Đại họ c

Lâm nghiệp đã có nhiều đóng góp giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn sƣ̣ giúp đỡ và tạo điều kiện vô cùng quý báu củ a Ban Giám

hiệu, các thầy các cô trong khoa Khoa học Sự sống , phòng Sau đại họ c Trƣờng Đại

học khoa học – Đại họ c Thái Nguyên để tôi có thể hoàn thành tốt khóa họ c .

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến nhƣ̃ng ngƣời thân trong gia đình và

bạn bè , đồng nghiệp đã tạo điều kiện , quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên và

khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập , thƣ̣ c hiện nghiên cƣ́u đề tài và thƣ̣ c hiện

thành công luận văn này.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hiền

iv

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦ U..............................................................................................................................1

1. Đặt vấn đề....................................................................................................................1

2. Mục tiêu nghiên cƣ́u....................................................................................................2

3. Nội dung nghiên cƣ́u...................................................................................................3

Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................................4

1.1. Giới thiệu về cây Xoan ta (Melia azedarach L.)...................................................4

1.1.1. Nguồn gốc và phân bố của cây Xoan ta..............................................................4

1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................................4

1.1.3. Giá trị sử dụng .......................................................................................................5

1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống Xoan ta..6

1.2. Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng ở thực vật.....................6

1.2.1. Cơ chế chịu mặn của thực vật...............................................................................8

1.2.2. Vai trò của glycine betain đối với tính chống chịu ở thực vật..........................12

1.2.3. Cơ chế sinh tổng hợp glycine betaine ................................................................13

1.2.4. Nguồn gốc và đặc điểm của gen codA...............................................................15

1.3. Sử dụng gen codA trong cải tạo giống cây trồng ..................................................15

Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................19

2.1. Vật liệu nghiên cƣ́u................................................................................................19

2.1.1. Vật liệu.................................................................................................................19

2.1.2. Hóa chất ...............................................................................................................20

2.1.3. Môi trƣờng nuôi câý ............................................................................................21

2.1.4. Thiết bị - Máy móc..............................................................................................22

2.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u.......................................................................................22

2.2.1. Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen codA .........................22

2.2.2. Tạo chủng vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen....29

2.2.3. Tạo cây Xoan ta chuyển gen mang gencodA...................................................30

Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................................34

3.1. Kết quả nhân dòng gen codA từ vector tách dòng pBluesript II SK - codA.......34

v

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.2. Kết quả thiết kế cấu trúc vector và tạo chủng vi khuẩn mang vector chuyển gen 35

3.2.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121- codA .............................35

3.2.2. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp (pBI121-codA) vào E. coli DH5α.............36

3.2.3. Kết quả sàng lọc dòng vi khuẩn E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp ...........37

3.2.4. Kết quả biến nạp vector chuyển gen (pBI121-codA) vào A. tumefaciens.......39

3.2.5. Kết quả sàng lọc dòng A. tumefaciens mang vector chuyển gen ...................40

3.3. Kết quả tạo dòng Xoan ta mang cấu trúc gen codA .............................................42

3.3.1. Kết quả chuyển gen và tái sinh chồi Xoan ta chuyển gen ................................42

3.3.2. Kết quả tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh (ra rễ) .................................................45

3.3.3. Kết quả ra cây và kiểm tra cây chuyển gen ngoài nhà lƣớ.............................. i 46

3.3.4. Kết quả đánh giá sơ bộ cácdòng Xoan ta chuyển gen trên môi trƣờng muố.i47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................................51

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................52

PHỤ LỤC...........................................................................................................................57

vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤ C CÁ C CHƢ̃ VIẾT TẮT

AS

bp

BAP

C:I

Acetosyrigone

Cặp base (base pair)

6-benzyl adenin purine

Chloroform : Isoamyl alcolhol

CodA

DNA

Gen mã hóa Choline oxydase

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Gus

Deoxynucleotide triphosphate

β-Glucuronidase gene = Gen mã hoá β- Glucuronidase

E. coli

EDTA

Escherichia coli

Ethylene Diamin Tetra Acetate

IBA Indole 3 - butyric acid

kb

LB

MS

kilo base (1 kb = 1000 base)

Luria – Bertani

Murashige and Skoog

OD

PCR

Mật độ quang học (Optical density)

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase

SDS

T-DNA

TAE

Ti-Plasmid

TE

WT

Sodium doecyl sulphate

Transfer – DNA = DNA chuyển

Tris base – Acetic acid – EDTA

Tumor inducing plasmid = Plasmid gây khối u thực vật

Tris-EDTA

Cây không chuyển gen

vii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤ C BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự các mồi nhân gencodA.......................................................................20

Bảng 2.2. Thành phần dung dịch tách plasmid.................................................................20

Bảng 2.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn ..........................................................................21

Bảng 2.4. Môi trƣờng nuôi vàchọn lọc cây Xoan ta chuyển gen...................................21

Bảng 2.5. Thành phần các loại môi trƣờng gây nhiễm mặn nhân tạ............................. o 22

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR nhân gen codA.....................................................23

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng xƣ̉ lý enzyme giới hạn.................................................24

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối gen codA với vector pBI121........................26

Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra plasmi................................ d ..................28

Bảng 2.10.Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn............29

Bảng 2.11. Thành phần dung dịch tách chiết DNA.........................................................32

Bảng 2.12. Thành phần phảnứng PCR kiểm tra DNA tổng số. ....................................33

Bảng 3.1. Kết quả tái sinh chồi Xoan ta chuyển gen sau hai lần chọn lọc .....................42

Bảng 3.3. Khả năng chịu mặn củ a các dòng Xoan ta chuyển gencodA.........................48