Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY

DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don )

LU N ÁN TI N S SINH HỌC

Thái Nguyên - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY

DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don )

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 9 42 01 21

LU N ÁN TI N S SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

2. GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2018

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của

PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm và GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả

trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các tạp chí khoa học

công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

Bùi Thị Hà

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu và

PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã chỉ bảo, động viên và tận tình hướng dẫn trong

suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn và các cán bộ, nghiên

cứu viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất

để tôi có thể hoàn thành một số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh học hiện

đại và Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học

Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có nhiều góp ý sâu sắc cho tôi

trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô và

các cán bộ bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái

Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Y Dược, chân thành

cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Khoa học cơ bản, Trường Đại học Y Dược – Đại

học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình học tập và công tác.

Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động

viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.

Thái Nguyên, tháng 02 năm 2018

TÁC GIẢ

Bùi Thị Hà

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan…………………………………………………................. i

Lời cảm ơn………………………………………………………..…....... ii

Mục lục………………………………………………………..………… iii

Danh mục những chữ viết tắt trong luận án…………………………….. vi

Danh mục bảng trong luận án…………………………………………… ix

Danh mục hình trong luận án…………………………………………… xi

MỞ ĐẦU…………………………………………………...…………… 1

1.Đặt vấn đề……………………………………………………………. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………….. 2

3. Nôi dung nghiên cứu………………………………………………..... 2

4. Những đóng góp mới của luận án………………………………...….. 3

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án…………………….. 3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………..... 4

1.1.Alkaloid ………………………………………………..………….. 4

1.1.1. Vai trò của alkaloid thực vật........................................................... 4

1.1.2. Alkaloid ở cây dừa cạn…………………………………………... 6

1.2. Sinh tổng hợp alkaloid và hoạt động của enzyme DAT ở cây dừa cạn.. 10

1.2.1. Quá trình sinh tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn…………...…….. 10

1.2.2. Hoạt động của enzyme DAT và gen DAT................................... 16

1.3. Nghiên cứu cải thiện hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn.................... 18

1.3.1. Nâng cao hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn bằng phương pháp

iv

nuôi cấy mô tế bào thực vật……………………...................................... 18

1.3.2. Nâng cao hàm lượng alkaloid bằng kỹ thuật chuyển gen………. 21

Chƣơng 2. V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 27

2.1. Vật liệu nghiên cứu .………………………………………………. 27

2.1.1. Vật liệu thực vật…………………………………………………. 27

2.1.2. Chủng vi khuẩn và các loại vector………………………………. 27

2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu………………………... 27

2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu…………………………………… 27

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án……………………. 28

2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………….. 29

2.3.1. Các phương pháp sinh học phân tử……………………………… 29

2.3.2. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT 33

2.3.3. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc lá..................... 37

2.3.4. Tái sinh và chuyển gen gus ở cây dừa cạn...................................... 38

2.3.5. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây dừa cạn thông qua

A.tumefaciens............................................................................................. 43

2.3.6. Phương pháp phân tích cây chuyển gen......................................... 45

2.3.7. Phương pháp tính hiệu suất chuyển gen………………………… 49

2.3.8. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu……………………… 49

Chƣơng 3. K T QUẢ VÀ THẢO LU N………………………….... 50

3.1. Đặc điểm của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn.......................... 50

3.1.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen

v

CrDAT…………………………………………………………………………..

3.1.2. So sánh trình tự nucleotite của gen CrDAT.............................

50

52

3.2. Thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá 56

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT……. 56

3.2.2. Phân tích biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá chuyển gen........ 61

3.2.3. Thảo luận kết quả thiết kế và đánh giá hoạt động của vector

chuyển gen pBI121-CrDAT………………………………………………… 67

3.3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh và xây dựng quy trình chuyển gen ở

cây dừa cạn................................................................................................ 70

3.3.1. Nuôi cấy in vitro cây dừa cạn…………………………………… 70

3.3.2. Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua gen gus………………... 76

3.3.3. Kết quả chuyển gen gus vào cây dừa cạn ..................................... 82

3.4. Kết quả chuyển gen CrDAT và tạo cây dừa cạn chuyển gen...................... 87

3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT và tái sinh cây dừa cạn chuyên gen.. 87

3.4.2. Xác định sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong

hệ gen của các cây dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T0................................. 89

3.4.3. Phân tích biểu hiện protein DAT tái tổ hợp ở thế hệ T1................. 92

3.4.4. Thảo luận về kết quả sự tăng cường biểu hiện gen CrDAT ở cây

dừa cạn chuyển gen…………………………………………………… 96

K T LU N VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………... 100

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIỆN QUAN Đ N LU N ÁN…. 101

TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 102

PHỤ LỤC……………………………………………………………... 119

vi

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VI T TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

AS Acetosyringone

A. Tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

A. Rhizogenes Agrobacterium rhizogenes

BAP Benzylaminopurine

35S Promoter CaMV 35S

bp base pair Cặp bazơ nitơ

cs cộng sự

CCM Cocultivation medium

Môi trường đồng nuôi

cấy

DNA Deoxyribonucleic acid

cDNA Complementary DNA DNA bổ sung

CTAB

Cetyltrimethyl ammonium

Bromide

CrDAT

Cathanthus roseus Deacetyl

vindoline 4-O-acetyltransferase

Gen CrDAT

DEPC Diethyl pyrocarbonate

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

E. coli Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic

acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent

assay

Phản ứng ELISA

GM Germination Medium Môi trường tái sinh

gus β-Glucuronidase

IAA Indole Acetic acid

IPTG

Isopropyl β-D-1-

thiogalactopyranoside

vii

Kb Kilo base

kDa Kilo Dalton

LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng

cơ bản nuôi cấy vi khuẩn

MS Murashige và Skoog Tên gọi đặt cho môi

trường dinh dưỡng cơ

bản nuôi cấy mô thực vật

mRNA Messenger ribonucleic acid

NAA Naphthaleneacetic acid

NptII Neomycyn phosphatranferaseII Gen kháng kanamycine

OD Optical density Mật độ quang

PCR Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi

polymerase

RNA Ribonucleic acid

RM Rooting medium Môi trường tạo rễ

rCrDAT Recombinant CrDAT protein Protein DAT tái tổ hợp

SDS Sodium dodecyl sulfate

SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi

SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi

TAE Tris Acetate EDTA

Taq DNA

polymerase

Thermus aquaticus DNA

polymerase

T-DNA Transfer DNA

Đoạn DNA được chuyển

vào thực vật

T0, T1

Các thế hệ cây chuyển

gen

T0

Cây chuyển gen tái sinh

từ chồi trong ống nghiệm

T1

Hạt của cây chuyển gen

T0 nảy mầm thành cây

viii

T1

TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

WT Wild type Cây không chuyển gen

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β￾D-galacto-pyranoside

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

ix

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu......................................... 30

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR............................................................ 31

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen CrDAT vào vector tách dòng........ 32

Bảng 2.4. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn................................... 32

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt DNA bằng BamHI…………………… 33

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI/ NcoI………………. 35

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII........................... 36

Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide của gen

CrDAT...............................................................................................................

52

Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn của protein

DAT ở mẫu dừa cạn TN1, TN2 và protein mang mã số AAC99311 trên Ngân

hàng Gen................................................................................................

55

Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc

lá...................................................................................................................

63

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ đoạn

thân mang mắt chồi bên……………………………………………………..

71

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của sự kết hợp BAP 1,0mg l với IBA đến sự phát sinh

chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên………….

72

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của BAP đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của

chồi từ nách lá mầm……………………………………………………........

74

Bảng 3.7. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 0,5mg l và IBA đến sự phát sinh và

sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm……………………………..…............. 75

x

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của mật độ A. tumefaciens đến tỷ lệ biểu hiện gen gus

tạm thời khi lây nhiễm qua nách lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên........

77

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus. 78

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ biểu hiện tạm

thời gen gus ...................................................................................................

80

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ Km đến chọn lọc mẫu chuyển gen....... 81

Bảng 3.12. Kết quả chuyển gen gus vào dừa cạn........................................... 83

Bảng 3.13. Kết quả biến nạp cấu trúc CrDAT vào mẫu dừa cạn hoa hồng tím.. 89

xi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus roseus………………………….. 7

Hình 1.2. Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp các terpenoid indole

alkaloid (TIA)……........................................................................................

11

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của viblastine và vincristine............................ 15

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát…………………………………….... 29

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT …………….... 34

Hình 2.3.Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây dừa cạn qua nách lá mầm... 43

Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT………... 50

Hình 3.2. Trình tự nucleotide của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn mẫu

TN1, TN2 và trình tự mang mã số AF053307 trên Ngân hàng gen quốc tế.. 53

Hình 3.3. Trình tự amino acid suy diễn của gen CrDAT từ hai mẫu dừa cạn

TN1, TN2 và của protein mang mã số AAC99311 trên Ngân hàng Gen. ....

54

Hình 3.4. Kết quả cắt vector tách dòng tái tổ hợp pBT-CrDAT với cặp

enzyme giới hạn NcoI và NotI…………………….......................................

57

Hình 3.5. Kết quả cắt mở vòng vector pRTRA7 3………………………… 58

Hình 3.6. Kết quả tạo vector tái tổ hợp pRTRA7 3-CrDAT………………... 59

Hình 3.7. Kết quả tạo vector chuyển gen pBI121-CrDAT............................. 60

Hình 3.8. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT và kết quả

điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR.........................................................

61

Hình 3.9. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp, chọn lọc và tái sinh tạo cây thuốc

lá chuyển gen..........................................................................................................

62

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen