Nghiên cứu sự phân bố của các chủng vi sinh vật sinh phytase trong một số loại đất tại huyện hòa vang, thành phố đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

---------------------------------------

BÙI THỊ NGUYÊN NỮ

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC CHỦNG

VI SINH VẬT SINH PHYTASE TRONG MỘT SỐ LOẠI ĐẤT

TẠI HUYỆN HÒA VANG, THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

SINH THÁI HỌC

Đà Nẵng – Năm 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

---------------------------------------

BÙI THỊ NGUYÊN NỮ

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC CHỦNG

VI SINH VẬT SINH PHYTASE TRONG MỘT SỐ LOẠI ĐẤT

TẠI HUYỆN HÒA VANG, THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Chuyên ngành : SINH THÁI HỌC

Mã số : 8420120

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. NGUYỄN HUY THUẦN

2. PGS. TS ĐỖ THU HÀ

Đà Nẵng – Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

BÙI THỊ NGUYÊN NỮ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU : Colony Foming Unit (Đơn vị khuẩn lạc)

CT : Công thức

HSCC : Hệ sợi cơ chất

HSKS : Hệ sợi khí sinh

MT : Môi trường

NM : Nấm mốc

STT : Số thứ tự

TB : Trung bình

TP : Thành phố

VK : Vi khuẩn

VKTSHK : Vi khuẩn tổng số hiếu khí

VSV : Vi sinh vật

VSVHK : Vi sinh vật hiếu khí

VSVTS : Vi sinh vật tổng số

VSVTSHK : Vi sinh vật tổng số hiếu khí

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

bảng

Tên bảng Trang

1.1 Phytase từ những nguồn khác nhau 12

2.1 Thành phần phản ứng PCR 26

2.2 Mã số trình tự 18S rARN của một số loài nấm mốc 28

3.1

Số lượng, thành phần các chủng VSV sinh phytase trong đất tại

một số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (từ

tháng 03/2017 đến tháng 05/2017)

30

3.2

Số lượng, thành phần các chủng VSV sinh phytase trong đất tại

một số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (từ

tháng 06/2017 đến tháng 08/2017)

31

3.3

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 03/2017)

34

3.4

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 04/2017)

Phụ lục

3.5

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 53/2017)

Phụ lục

3.6

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 04/2017)

Phụ lục

3.7

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 07/2017)

35

3.8

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 08/2017)

Phụ lục

3.9

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 09/2017)

36

3.10

Số lượng VSV sinh phytase theo thành phần cơ giới đất tại một

số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

37

Số hiệu

bảng

Tên bảng Trang

3.11

Số lượng nấm môc sinh phytase theo thời gian (tháng) tại một

số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (x 104

CFU/g)

39

3.12

Số lượng nấm mốc sinh phytase theo độ ẩm đất tại một số xã

thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

43

3.13

Khả năng sinh enzyme phytase của một số chủng NM và VK

trên môi trường PSM có bổ sung CaCl2

47

3.14

Đặc điểm nuôi cấy và hình thái chủng VK-2 sinh phytase

mạnh

52

3.15

Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc NM-1, NM-4 sinh phytase

mạnh

53

3.16

Hoạt độ enzyme của chủng MN-1, MN-4 và VK -2

qua các thời gian nuôi cấy

57

3.17

Chiều cao trung bình cây lúa qua các công thức sau 7 ngày

gieo trồng

62

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

hình

Tên hình Trang

1.1 Phản ứng xúc tác của enzyme phytase 8

1.2 Bản đồ hành chính huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng 18

2.1 Chương trình chạy PCR 27

3.1

Một số chủng nấm mốc sinh phytase trong đất phân lập được tại

một số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

33

3.2

Một số chủng vi khuẩn sinh phytase trong đất phân lập được tại

một số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

33

3.3 Động thái nấm mốc sinh phytase theo thời gian (tháng) 40

3.4 Động thái nấm mốc sinh phytase theo độ ẩm 44

3.5

Tỉ lệ % các chủng vi khuẩn, nấm mốc có khả năng sinh phytase

mạnh

48

3.6 Hai chủng vi khuẩn có khả năng sinh phytase mạnh 49

3.7 Bốn chủng nấm mốc có khả năng sinh phytase mạnh 49

3.8

Phân giải acid phytate của chủng NM-1 và NM-4 phân lập được

từ mẫu đất tại xã Hòa Tiến và Hòa Châu

51

3.9

Phân giải acid phytate của chủng NM-6 và NM-7 phân lập được

từ mẫu đất tại xã Hoà Khương

51

3.10

Phân giải acid phytate của chủng VK-2 và VK-4 phân lập được

từ mẫu đất tại xã Hòa Châu và Hòa Sơn

52

3.11

Khuẩn lạc của chủng VK2 trên môi trường LB sau 3 ngày nuôi

cấy

54

3.12 Hình ảnh ống giống của chủng VK2 sau 3 ngày nuôi cấy 54

3.13

Chủng nấm mốc NM-1 nuôi cấy trên môi trường PDA

sau 2 ngày nuôi cấy 55

3.14 Cơ quan sinh sản của chủng nấm mốc NM-1 dưới kính hiển vi 55

3.15 Chủng nấm mốc NM-4 nuôi cấy trên môi trường PDA 56

Số hiệu

hình

Tên hình Trang

Sau 2 ngày nuôi cấy

3.16 Cơ quan sinh sản của chủng nấm mốc NM-4 dưới kính hiển vi 56

3.17

Thu dịch lỏng nuôi cấy các chủng tuyển chọn qua thời gian nuôi

cấy

57

3.18 Dịch nuôi cấy lỏng qua 120 giờ nuôi cấy 57

3.19

Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của mẫu

NM1

59

3.20

Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của mẫu

NM4

59

3.21

Giản đồ phả hệ chủng nấm NM1, NM4 và một số chủng nấm

khác dựa trên so sánh trình tự nucleotide của gen mã hóa 18S

rARN

60

3.22

Các khay CT1, CT2, CT3, CT4 theo thứ tự lần lượt từ 1, 2, 3, 4

sau 7 ngày gieo trồng

63

3.23

Chiều cao các cây ngẫu nhiên của các khay CT1, CT2, CT3, CT4

theo thứ tự lần lượt từ 1, 2, 3, 4

63

1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Phospho là một chất dinh dƣỡng quan trọng đối với sự sinh trƣởng và phát

triển của thực vật, nhƣng hầu hết phospho có trong đất cây trồng không hấp thu

đƣợc do sự cố định nhanh chóng của các thành phần hữu cơ và vô cơ trong đất [20].

Sự thiếu hụt phospho dẫn đến một số thay đổi về hình thái và sinh lý, ảnh hƣởng

đến sự tăng trƣởng, năng suất và sự sống còn của cây trồng, điều này là một điểm

yếu cho ngành nông nghiệp trên toàn thế giới. Ngày nay, việc sử dụng rộng rãi các

loại khoáng chất để sản xuất phân bón hóa học bổ sung phospho cho cây trồng trở

nên phổ biến. Dựa trên mức sử dụng hiện tại, ƣớc tính trữ lƣợng khoáng chất sẽ bị

cạn kiệt trong vòng 50 năm tới [15]. Chính vì vậy, nghiên cứu chế phẩm sinh học

cải thiện sự hấp thụ và sử dụng phospho của thực vật sẽ tác động đáng kể đối với

ngành nông nghiệp và môi trƣờng.

Phytate là dạng lƣu trữ chính của phospho (60-90%) trong thực vật và là

nguồn ô nhiễm phospho chủ yếu trong phân gia súc [11]. Các dạng phytate khác

nhau tồn tại dƣới dạng đất sét hoặc kết tủa dƣới dạng các muối sắt, muối nhôm có

tính axit hoặc các muối canxi không hoà tan trong đất. Hơn nữa, phytate có khả

năng tạo phức với các ion kim loại cần thiết cho độ phì của đất nên có ảnh hƣởng

xấu đến sự tăng trƣởng của thực vật [25].

Phytase là enzyme có tác dụng thủy phân phytate tạo thành phospho và myo￾inositol, vì thế có thể sử dụng phytase để thay thế các chất bổ sung phosphate hiện

có. Phytase cũng có thể đƣợc khai thác vì khả năng hòa tan các khoáng chất thiết

yếu trong đất và có tác dụng chống lại khả năng tạo phức của phytate [25]. Vào năm

2002, Idriss cũng đƣa ra các dữ liệu để chứng minh lƣợng phytase đƣợc tiết ra từ vi

khuẩn Bacillus amyloliquefaciens FZB45 kích thích sự phát triển của cây bắp con

trồng trong hệ thống vô trùng chứa môi trƣờng kiểm soát phosphate bằng cách bổ

sung acid phytate [29]. Những nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc

chứng minh vi sinh vật sản sinh enzyme phytase trong đất có ảnh hƣởng tích cực

đến dinh dƣỡng phospho trong cây. Các nghiên cứu còn chỉ ra rằng, enzyme

2

phytase còn góp phần giúp cho cây có thể hấp thụ nguồn nitơ và kali tốt hơn, và

đƣợc xem nhƣ một nguồn thay thế phân bón hóa học [39].

Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã đƣợc tìm thấy ở nhiều loài vi sinh

vật, mô thực vật và động vật. Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thƣờng thấy nhất ở

nấm mốc đặc biệt ở các loài thuộc chi Aspergillus. Phytase cũng đã đƣợc tìm thấy

trong các nhóm vi khuẩn nhƣ: Aerobacter aerogene, Pseudomonas sp, Bacillus

subtilis, Klebsiella, Escherichia coli, Enterobacter sp và Bacillus

amyloliquefaciens. Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào là những chủng thuộc về

chi Bacillus và Enterobacter [6] [10].

Thành phố Đà Nẵng có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm rất thuận lợi cho vi sinh vật

nói chung và vi sinh vật sinh phytase nói riêng phát triển. Vì vậy tại thành phố Đà

Nẵng có thể tìm thấy nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh nhiều enzyme, chất

kích thích sinh trƣởng thực vật, chất kháng sinh quý hiếm. Do đó việc phân lập khu

hệ vi sinh vật đất tại Đà Nẵng sẽ có tiềm năng lớn trong tuyển chọn đƣợc các chủng

vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase mạnh, đồng thời, tìm kiếm các nguồn

gen quý nhằm phục vụ cho các công tác nghiên cứu chế phẩm sinh học thay thế

phân bón hóa học cung cấp phospho cho cây trồng tại địa phƣơng.

Xuất phát từ những lí luận khoa học và thực tiễn nêu trên, thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu sự phân bố của các chủng vi sinh vật sinh phytase trong một số loại

đất tại huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng”.

2. Mục tiêu đề tài

Xác định sự phân bố của các chủng vi sinh vật sinh phytase trong một số loại

đất tại huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng làm cơ sở khoa học cho việc đề xuất

các biện pháp ứng dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh phytase mạnh tại địa

phƣơng một cách hợp lý.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Kết quả của đề tài sẽ bổ sung cho các nghiên cứu trƣớc về sự phân bố của

các chủng vi sinh vật sinh phytase.

3

- Các chủng vi sinh vật phân lập sẽ là nguồn giống để ứng dụng tạo chế phẩm

sinh học thay thế phân bón hóa học bổ sung phospho cho cây trồng tại địa phƣơng

một cách hợp lí.

4. Cấu trúc của luận văn

Luận văn có 72 trang gồm các phần sau:

- Mở đầu (3 trang)

- 3 chƣơng:

+ Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu (16 trang)

+ Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu (9 trang)

+ Chƣơng 3: Kết quả và biện luận (36 trang)

- Kết luận và kiến nghị (2 trang)

- Tài liệu tham khảo (6 trang)

- Phần phụ lục