Nghiên cứu sự dimer hóa của protein RHAU dung hợp được cảm ứng bởi cấu trúc G-quadruplex song song

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

PHAN HÙNG VIỆT

NGHIÊN CỨU SỰ DIMER HÓA CỦA PROTEIN

RHAU DUNG HỢP ĐƯỢC CẢM ỨNG BỞI

CẤU TRÚC G-QUADRUPLEX SONG SONG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

PHAN HÙNG VIỆT

NGHIÊN CỨU SỰ DIMER HÓA CỦA PROTEIN

RHAU DUNG HỢP ĐƯỢC CẢM ỨNG BỞI

CẤU TRÚC G-QUADRUPLEX SONG SONG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn 1 : TS. ĐẶNG THANH DŨNG

Giảng viên hướng dẫn 2 : PGS.TS PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Phan Hùng Việt

Ngày sinh: 10/06/1983 Nơi sinh: Bình Thuận

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên: 1884202010011

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho

Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở

Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống

thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Nghiên cứu sự dimer hóa của protein RHAU dung hợp

được cảm ứng bởi cấu trúc G-quadruplex song song” là bài nghiên cứu của chính tôi.

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam đoan rằng

toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố hoặc được sử

dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác.

Không có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn này

mà không được trích dẫn theo đúng quy định.

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các trường đại

học hoặc cơ sở đào tạo khác.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2021

Phan Hùng Việt

ii

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đặng Thanh Dũng và PGS.TS. Phan Thị Phượng

Trang đã hướng dẫn em trong toàn bộ quá trình thực hiện luận văn. Cảm ơn thầy cô đã

hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất để em được học tập, và hoàn thành

tốt luận văn.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học

Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi để em có cơ hội học tập, trau dồi

kiến thức, tiếp cận những điều kiện tốt nhất trong nghiên cứu.

Đồng thời cũng cảm ơn tới các anh chị, các bạn, các em ở Trung tâm Khoa học và

Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, trao đổi và tạo điều kiện trong suốt quá trình

thực hiện đề tài.

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình đã luôn là điểm tựa vững chắc trong bất cứ hoàn

cảnh nào.

Xin cảm ơn tất cả mọi người!

Phan Hùng Việt

iii

TÓM TẮT

Nhiều protein trong hệ thống sống thường kết hợp với nhau tạo thành cấu trúc

oligomer giúp tăng cường tính ổn định và thực hiện các chức năng sinh học. Trong đó,

các nghiên cứu đã cho thấy protein dimer đóng góp nhiều vai trò quan trọng trong hoạt

động sinh trưởng của tế bào. Vì thế, các phương pháp cảm ứng tạo protein dimer đã ra

đời nhằm giúp con người chủ động trong việc điều hòa các quá trình sinh học và tiến tới

ứng dụng trong y học. Đầu tiên, phương pháp thiết kế protein mặc dù đã mang lại những

kết quả đáng chú ý nhưng sự dimer chỉ diễn ra theo chiều thuận, dẫn đến việc điều hòa

hoạt tính của protein bị cản trở. Để khắc phục nhược điểm này, phương pháp sử dụng

các chất cảm ứng bên ngoài đã được nghiên cứu và phát triển. Cho đến nay, nhiều chất

cảm ứng khác nhau đã được sử dụng song vẫb tồn tại những hạn chế nhất định. Chẳng

hạn, việc sử dụng rapamycin đòi hỏi protein mục tiêu dung hợp với những protein

domain có kích thước lớn có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein mục tiêu. Trong

khi đó, cucurbit[8]uril trong hệ thống chủ khách thì ít tan và khó chuyển vào tế bào. Vì

vậy, việc tìm ra phân tử mới để cảm ứng sự dimer protein là điều rất đáng quan tâm và

G-quadruplex là một phân tử có nhiều tiềm năng cho mục tiêu này vì những ưu điểm

sau: là trình tự RNA hay DNA nên ít gây trở ngại cho tế bào, kích thước ngắn và dễ tổng

hợp hóa học…

Các công bố khoa học đã chứng minh rằng 1 phân tử G-quadruplex có thể liên

kết đặc hiệu với 2 phân tử protein RHAU. Kết quả này đã hình thành nên ý tưởng dung

hợp các protein mục tiêu với đoạn peptide RHAU, sau đó áp dụng sự tương tác đặc hiệu

giữa G-quadruplex và RHAU để cảm ứng sự dimer protein. Ngoài ra, để đánh giá sự

dimer hóa của protein, có thể sử dụng phương pháp FRET (Fluorescence Resonance

Energy Transfer) với cặp protein chỉ thị màu là CFP và YFP (Cyan Fluorescent Protein

và Yellow Fluorescent Protein). Các protein này có phần quang phổ chồng lấp thỏa mãn

điều kiện của FRET, đồng thời chúng là các protein dễ biểu hiện, có ánh sáng phát quang

bền và dễ quan sát.

iv

Từ những nhận định trên, đề tài đặt ra mục tiêu “Nghiên cứu sự dimer hóa protein

dung hợp với RHAU bởi cấu trúc G-quadruplex song song” nhằm tìm ra một phân tử

mới và có tiềm năng cảm ứng sự dimer protein. Để hoàn thành được mục tiêu trên, đề

tài đã thực hiện các nội dung:

- Dòng hóa tạo plasmid pTD14 mang gen mã hóa cho protein RHAU-YFP

- Kiểm tra sự biểu hiện của protein RHAU-YFP trong E. coli BL21(DE3)

- Tinh chế thu nhận protein mục tiêu RHAU-YFP.

- Kiểm tra sự dimer hóa của RHAU-CFP/RHAU-YFP được cảm ứng bởi cấu trúc

G-quadruplex T95-2T bằng phương pháp FRET.

Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh và đạt được các kết quả:

- Tạo dòng thành công vector pTD14 mang gen mã hóa cho protein dung hợp

RHAU-YFP.

- Biểu hiện được protein RHAU-YFP trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) với nồng

độ chất cảm ứng là 0,05 mM IPTG ở 16оC qua đêm.

- Thu nhận thành công protein RHAU-YFP bằng cột tinh chế HisTrap.

- Chứng minh được phân tử G-quadruplex T95-2T đã cảm ứng sự dimer hóa của

protein RHAU-CFP và RHAU-YFP.

- Xác định được nồng độ G-quadruplex T95-2T tối ưu cho khả năng cảm ứng sự

dimer hóa cao nhất trong điều kiện thí nghiệm là 500 µM.

Về ý nghĩa, đề tài đã tạo ra một mô hình cho hệ thống cảm ứng mới G-quadruplex￾RHAU tiềm năng cho việc nghiên cứu sự dimer của các protein và tiến tới ứng dụng trên

các protein chức năng trong tế bào.

v

ABSTRACT

The dimerization of proteins plays an important role in cellular activities such as enzyme

activation, signal transmission through receptors and regulation of gene expression.

Methods that mediate protein dimerization are introduced and developed to help regulate

biological processes. G-quadruplex is a potential molecule mediating the dimerization

of proteins through specifically binding to two RHAU peptides. However, to date, this

function of G-quadruplex has not been extensively studied. In this study, we cloned

vector pTD14 carrying the yfp gene fusing with RHAU peptide. RHAU-YFP protein

was then expressed and purified. Dimerization of this protein and RHAU-CFP protein

was mediated by G-quadruplex and observed by FRET reaction. The results showed that

RHAU-YFP protein could be expressed from the cloned vector pTD14 under the

temperature of 16OC and the IPTG concentration of 0.05 mM in 24 hours. The highest

amount of the target protein was yielded with imidazole concentrations between 20 mM

and 100 mM when purified through His-tag column. The FRET reaction showed that G￾quadruplex was capable of mediating the dimerization of proteins RHAU-YFP and

RHAU-CFP under the experimental conditions and G-quadruplex at concentration of

500 μM for the highest dimerization ability. The results can be used for further studies

on the application of G-quadruplex to regulate biological processes in medical research.

vi

MỤC LỤC

Lời cam đoan ................................................................................................................i

Lời cảm ơn ..................................................................................................................ii

Tóm tắt .......................................................................................................................iii

Abstract........................................................................................................................v

Mục lục .......................................................................................................................vi

Danh mục hình và đồ thị ..........................................................................................ix

Danh mục bảng............................................................................................................x

Danh mục chữ viết tắt ...............................................................................................xi

Chương 1. GIỚI THIỆU ............................................................................................1

1.1. Cơ sở hình thành luận văn....................................................................................1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................2

1.3. Câu hỏi nghiên cứu ..............................................................................................2

1.4. Phạm vi và đối tượng nghiên cứu ........................................................................3

1.4.1. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................3

1.4.2. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................3

1.5. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................3

1.6. Ý nghĩa nghiên cứu ..............................................................................................3

1.7. Kết cấu luận văn...................................................................................................3

Chương 2. CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ..................................................5

2.1. Sự dimer hóa protein............................................................................................5

2.1.1. Khái niệm.......................................................................................................5

2.1.2. Vai trò ............................................................................................................5

2.1.3. Các phương pháp cảm ứng sự dimer protein.................................................6

2.1.3.1. Phương pháp thiết kế protein .....................................................................7

2.1.3.2. Phương pháp sử dụng các chất bên ngoài..................................................8

2.2. G-quadruplex......................................................................................................12

2.2.1. Cấu trúc........................................................................................................12

vii

2.2.2. Phân loại ......................................................................................................13

2.2.3. Chức năng....................................................................................................14

2.2.4. Tiềm năng của G-quadruplex cho nghiên cứu sự dimer protein .................15

2.3. Protein RHAU....................................................................................................16

2.3.1. Cấu trúc........................................................................................................16

2.3.2. Chức năng....................................................................................................16

2.3.3. Tương tác giữa RHAU và G-quadruplex ....................................................17

2.4. Kiểm tra sự dimer protein bằng phương pháp FRET.........................................20

2.4.1. Cơ chế ..........................................................................................................20

2.4.2. Thể cho CFP và thể nhận YFP ....................................................................21

Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.........................................................26

3.1. Vật liệu ...............................................................................................................26

3.1.1. Dụng cụ và thiết bị.......................................................................................26

3.1.2. Hóa chất.......................................................................................................27

3.1.2.1. Hóa chất dùng trong dòng hóa .................................................................27

3.1.2.2. Hóa chất dùng trong biểu hiện, tinh chế protein và kiểm tra FRET........28

3.1.3. Hóa chất khác ..............................................................................................29

3.1.4. Môi trường...................................................................................................29

3.1.5. Vật liệu sinh học ..........................................................................................29

3.2. Phương pháp.......................................................................................................33

3.2.1. Dòng hóa tạo vector pTD14 mang gen mã hòa protein RHAU-YFP .........33

3.2.1.1. Thu nhận gen yfp bằng phương pháp PCR ..............................................33

3.2.1.2. Xử lý plasmid pTD1 và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn.........35

3.2.1.3. Tạo plasmid tái tổ hợp mang gen mục tiêu pTD14 .................................35

3.2.1.4. Biến nạp sản phẩm nối vào chủng E. coli OmniMAX ............................36

3.2.1.5. Sàng lọc các dòng tế bào E. coli OmniMAX mang plasmid pTD14.......37

3.2.2. Kiểm tra sự biểu hiện của protein RHAU-YFP trong E. coli BL21(DE3)..38