Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN MẠNH KIÊN

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN

CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA POLYMERASE

CỦA VIRUS CÖM A/H5N1 ĐƢƠNG NHIỄM

TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành : HÓA SINH Y HỌC

Mã số : 62 72 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. LÊ THANH HÒA

2. PGS.TS. ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án của mình, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu

sắc tới các Thầy (Cô):

- PGS.TS. Lê Thanh Hòa – Viện Công nghệ sinh học,

- PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung – Trƣờng Đại học Y Hà Nội,

đã trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận án này.

- Thầy Chủ tịch Hội đồng và các Thầy (Cô) trong Hội đồng chấm luận án,

cùng các nhà khoa học trong cả nƣớc, đã có nhiều ý kiến quí báu, giúp tôi hoàn

thiện luận án của mình.

Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình,

tôi nhận đƣợc sự giúp đỡ quí báu của Nhà trƣờng, đơn vị công tác, tập thể, các nhà

khoa học, gia đình và bè bạn. Tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Y Hà Nội; Ban lãnh đạo Bệnh viện quân y

7A, Cục Hậu cần, Quân khu 7, đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá

trình học tập và nghiên cứu tại trƣờng.

- Thầy, cô và các anh, chị trong Bộ môn Hóa sinh, Phòng Quản lý đào tạo Sau

đại học, Trung tâm Gen và Protein – Trƣờng Đại học Y Hà Nội, Phòng Miễn dịch

học – Viện Công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện giúp đỡ chỉ bảo tôi trong suốt quá

trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án.

- Cơ quan thú y các vùng trong cả nƣớc hết lòng ủng hộ, cung cấp mẫu bệnh

phẩm và thông tin dịch bệnh giúp tôi thực hiện đề tài nghiên cứu.

- Ban chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái

Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc-xin phòng chống”, trong khuôn khổ Nhiệm

vụ “Nghị định thƣ hợp tác nghiên cứu với Thái Lan”, đã giúp đỡ hỗ trợ tôi kinh phí

thực hiện đề tài nghiên cứu của mình.

- Cuối cùng, tôi xin đƣợc cảm ơn gia đình và ngƣời thân, đã hỗ trợ động viên

tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu của mình.

Hà Nội, ngày …tháng 8 năm 2014

NGHIÊN CỨU SINH

Nguyễn Mạnh Kiên

LỜI CAM ĐOAN

- Tôi xin cam đoan số liệu trong luận án là một phần số liệu đề tài nghiên cứu

Nghị định thƣ hợp tác nghiên cứu với Thái Lan có tên: “Nghiên cứu virus cúm

A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc - xin phòng

chống”. Phần kết quả trong đề tài luận án này là thành quả nghiên cứu của tập thể

mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã đƣợc sự đồng ý của Chủ nhiệm đề tài và toàn

bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu, cho phép sử dụng phần số liệu trên vào

trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ.

- Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là hoàn toàn trung thực. Một

phần số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án đã đƣợc công bố trên các Tạp chí

khoa học chuyên ngành, với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn

lại chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác.

Hà Nội, ngày ….tháng 08 năm 2014

TÁC GIẢ

Nguyễn Mạnh Kiên

i

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục i

Danh mục chữ viết tắt trong luận án iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình và sơ đồ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3

1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A 3

1.1.1. Cấu tạo chung của virus cúm A 3

1.1.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A 4

1.1.3. Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A 5

1.1.4. Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA 7

1.1.5. Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A 12

1.1.6. Đặc tính biến đổi di truyền các gen và hệ gen virus cúm A 14

1.2. ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ

PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƢỜI 16

1.2.1. Các đại dịch cúm A ở ngƣời trong lịch sử 16

1.2.2. Đặc điểm biến đổi các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại dịch

cúm ở ngƣời 17

1. 3. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1 22

1.3.1. Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1 22

1.3.2. Đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5N1 26

1.4. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC

LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƢỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 28

1.4.1. Trên thế giới 28

1.4.2. Tại Việt Nam 30

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 33

2.1.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu 33

2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị 35

2.1.3. Các bộ kit sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu 36

2.1.4. Môi trƣờng sử dụng trong dòng hóa 36

2.1.5. Các hóa chất sử dụng trong điện di trên gel agarose 36

ii

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.2.1. Kỹ thuật tách chiết ribonucleic acid tổng số 38

2.2.2. Thiết kế các trình tự mồi nucleotide sử dụng trong nghiên cứu 38

2.2.3. Kỹ thuật RT-PCR 41

2.2.4. Tinh sạch DNA sản phẩm PCR 44

2.2.5. Kỹ thuật điện di nucleic acid trên gel agarose 45

2.2.6. Kỹ thuật dòng hóa DNA 45

2.2.7. Giải trình tự DNA 48

2.2.8. Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide và amino acid của các gen

nghiên cứu 50

2.3. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 52

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53

3.1. KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA

CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 53

3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số và chuyển đổi cDNA hệ gen virus 53

3.1.2. Kết quả PCR thu nhận và dòng hóa DNA các gen PB2, PB1 và PA 54

3.1.3. Kết quả giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA 60

3.2. KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID

CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM

A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG THẾ GIỚI 61

3.2.1. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 61

3.2.1.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 61

3.2.1.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tƣơng đồng về nucleotide và amino acid gen PB2 65

3.2.2. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67

3.2.2.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67

3.2.2.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tƣơng đồng về nucleotide và amino acid gen PB1 69

3.2.2.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 69

3.2.2.4 Kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 73

3.2.3. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73

3.2.3.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73

3.2.3.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tƣơng đồng về nucleotide và amino acid gen PA 77

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ

PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 79

3.3.1. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 79

3.3.2. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 82

3.3.3. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 85

iii

Chƣơng 4. BÀN LUẬN 88

4.1. VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN

CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 88

4.1.1. Về kết quả thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88

4.1.2. Về qui trình nghiên cứu thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88

4.2. VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO

ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM

A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 89

4.2.1. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 89

4.2.2. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93

4.2.2.1 Về kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93

4.2.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 94

4.2.2.3 Về kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 96

4.2.3. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PA 97

4.3. VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1,

CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC

CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 99

4.3.1. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 99

4.3.2. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 102

4.3.3. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 103

4.4. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI PHỨC HỢP ENZYM POLYMERASE, TỔ HỢP

CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM

A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 105

4.3.1. Về đặc điểm biến đổi phức hợp enzym polymerase liên quan bệnh học và

dịch tễ học lây truyền sang ngƣời của virus cúm A/H5N1 105

4.3.2. Về nguồn gốc tổ hợp các gen PB2, PB1 và PA polymerase 108

KẾT LUẬN 114

KIẾN NGHỊ 116

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Nhãm

báng

s©u

(40

bÖnh

nh©n)

Nhãm

báng

trung b×

(20

bÖnh

nh©n)

Nhãm

®¾p

trªn

vïng

cho da

(20

bÖnh

nh©n)

BÖnh

nh©n

nghiªn

cøu (80

bÖnh

nh©n)

Nhãm

c¾t ho¹i

tö

(20

bÖnh

nh©n)

Nhãm

m« h¹t

(20

bÖnh

nh©n)

iv

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Chữ viết tắt/

Ký hiệu

Tên đầy đủ

bp base pair

Da dalton

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate

ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate

FAO Food and Agriculture Organization

HA Hemagglutinin

kb kilobase

M Matrix protein

MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis

NA Neuraminidase

NEP Nuclear Export Protein

NP Nucleoprotein

NS Non-structural protein

OIE Office International des Epizooties

PA Polymerase acidic protein

PB1 Polymerase basic protein 1

PB2 Polymerase basic protein 2

RT-PCR Reverse transcription - polymerase chain reaction

RNA Ribonucleic acid

RNP Ribonucleoprotein

(-) ssRNA Negative single-strand Ribonucleic Acid

WHO

cs.

World Health Organization

Cộng sự

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

1.1. Tóm tắt đặc tính cấu tạo 8 phân đoạn RNA hệ gen và chức năng các

protein của virus cúm A 6

1.2. Tóm tắt lịch sử các đại dịch và dịch cúm A ở ngƣời 17

1.3. Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2, PB1 và PA, giữa virus

cúm A ở gia cầm với chủng virus A/H1N1/1918 và virus cúm A ở ngƣời 19

1.4. Số ngƣời nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 từ 2003 đến nay 23

1.5. Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA, liên quan đến

độc lực và thích nghi lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên ngƣời 29

2.1. Danh sách 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 sử dụng trong nghiên cứu 33

2.2. Danh sách 19 chủng virus cúm A/H5N1 đại diện sử dụng trong so sánh

đặc tính di truyền các gen PB2, PB1 và PA 34

2.3. Danh sách 31 chủng virus cúm A/H5N1 bổ sung xây dựng cây phả hệ

nguồn gốc các gen PB2, PB1 và PA 35

2.4. Danh sách mồi chuyển cDNA, kiểm tra cDNA hệ gen, thu nhận và giải

trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu 39

2.5. Thành phần và qui trình phản ứng chuyển đổi cDNA hệ gen virus cúm

A/H5N1 từ RNA tổng số trong nghiên cứu 42

2.6. của kỹ thuật 6 biế

/H5N1 nghiên cứu 43

2.7. Chu t của kỹ thuật 6 biế

/H5N1 nghiên cứu 43

2.8. của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1

và PA từ cDNA hệ gen của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 44

2.9. Chu của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1 và PA

từ cDNA hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 44

2.10. Thành phần phản ứng ghép-nối đoạn cDNA sản phẩm PCR vào plasmid

pCR®

2.1-TOPO®

47

2.11. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng E.coRI 48

2.12. Thành phần phản ứng PCR giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA

của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 49

2.13. Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và

PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 50

3.1. Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự

gen PB2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 63

vi

Bảng Tên bảng Trang

3.2. Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2 của 25 chủng virus cúm

A/H5N1 đƣợc so sánh 64

3.3. Tỉ lệ tƣơng đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 của

25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 66

3.4. Các vị trí sai khác nucleotide trong trình tự protein PB1 dẫn đến thay đổi

amino acid trong protein PB1 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 68

3.5. Tỉ lệ tƣơng đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 của

25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 70

3.6. Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự

gen PB1-F2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 71

3.7. Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự

gen PA của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 75

3.8. Các vị trí thay đổi amino acid trong trình tự gen PA của 25 chủng virus

cúm A/H5N1 đƣợc so sánh 76

3.9. Tỉ lệ tƣơng đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PA của 25

chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 78

4.1. Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase,

liên quan độc lực gây bệnh, lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên ngƣời 106

4.2. Nguồn gốc tiến hóa xác định theo genotype của các gen PB2, PB1 và PA

polymerase, trong hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu và

các chủng virus tham chiếu phân lập từ năm 2003 đến nay 109

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình/

Sơ đồ

Tên hình, sơ đồ Trang

1.1. Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A 4

1.2. Mô hình cấu trúc hệ gen virus cúm A 5

1.3. Sơ đồ sắp sếp và trình tự vị trí codon AUG xác định điểm khởi đầu các

ORF trong vùng đầu 5’- RNA thông tin gen PB1 virus cúm A 9

1.4. Mô hình phân bố các vùng chức năng của protein PA 12

1.5. Mô hình cấu trúc 3D và vị trí phức hợp polymerase trong cấu trúc mỗi

phân đoạn RNP hệ gen của virus cúm A 12

1.6. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ 13

1.7. Sơ đồ minh họa đặc tính biến đổi di truyền của các phân đoạn và hệ gen

virus cúm A 15

1.8. Sơ đồ hình thành các virus cúm A gây đại dịch cúm ở ngƣời 21

1.9. ự hình thành và lƣu hành xâm nhiễm gây bệnh ở

ngƣời củ /H5N1 ở châu Á từ 2003 – 2011 23

1.10. Sơ đồ ổ hợp hình thành các genotype Z, G và V củ

/H5N1 24

1.11. 26

2.1. Sơ đồ qui trình tổng quát nghiên cứu các gen PB2, PB1 và PA

polymerase của virus cúm A/H5N1 37

2.2. Sơ đồ bố trí vị trí bám mồi chuyển cDNA, thực hiện kỹ thuật PCR và giải

trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1 41

2.3. Sơ đồ nguyên lí của kỹ thuật PCR 41

2.4. Sơ đồ cấu trúc của vector pCR®

2.1TOPO (Invitrogen) 47

3.1. Kết quả điện di kiểm tra DNA một phần gen HA(H5) với cặp mồi H5F1 – H5R1

của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 53

3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm

A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR 54

3.3. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB1 của 6 biến chủng virus cúm

A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR 55

3.4. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PA của 6 biến chủng virus cúm

A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR 56

3.5. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của 6

biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 57

viii

Hình/

Sơ đồ

Tên hình, sơ đồ Trang

3.6. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB1 của 6

biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 58

3.7. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PA của 6

biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 59

3.8. Các vị trí thay đổi amino acid trong trình tự protein PB1-F2 của 25

chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 72

3.9. Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự

nucleotide gen PB2 polymerase 80

3.10. Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự

nucleotide gen PB1 polymerase 83

3.11. Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự

nucleotide gen PA polymerase 86

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm nhiều phân type (subtype) lƣu

hành ở chim hoang dã, có khả năng biến đổi xâm nhiễm, lây truyền sang ngƣời và

nhiều loài động vật, nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm A ở ngƣời trong lịch sử.

Hệ gen củ (RNA) sợi đơn âm, gồm 8 phân

đoạn RNA riêng biệt là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS, lần lƣợt mã hóa

tổng hợp 12 protein tƣơng ứng đƣợc biết cho đến nay, đó là PB2, PB1, PB1-N40,

PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2. Các protein trên tham gia cấu tạo

hạt virus và đảm bảo các chức năng xâm nhiễm, độc lực và thích nghi lây truyền

gây bệnh của virus ở các loài vật chủ. Đặc biệt, phức hợp enzym polymerase của

virus cúm A không có cơ chế “đọc-sửa” bản sao trong quá trình sao chép, tổng hợp

các phân đoạn RNA hệ gen của hạt virus mới. Đặc tính cấu trúc hệ gen và enzym

polymerase giúp virus cúm A có khả năng đột biến cao, hình thành chủng virus mới

thay đổi độc lực hoặc chuyển nhiễm, thích nghi lây truyền sang nhiề

và ngƣời trong quá trình lƣu hành tự nhiên. Trong đó, các gen PB2, PB1 và PA mã

hóa tổng hợp 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase, là các đơn vị cấu tạo phức hợp

enzym polymerase, có vai trò quyết định khả năng thích nghi nhân lên và lây truyền

của virus ở cơ thể các loài vật chủ. Ngoài ra, gen PB1 còn chứa 2 khung đọc mở

gen PB1-F2 và PB1-N40 mã hóa tổng hợp các protein tƣơng ứng, tham gia biểu

hiện độc lực của virus cúm A ở cơ thể bị nhiễm.

Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao nguyên nhân gây ra

dịch cúm gia cầm và gây bệnh có tỉ lệ tử vong cao ở ngƣời (khoảng 60%), lan

truyền rộng rãi tới hơn 60 quốc gia trên thế giới. Trong đó, Việt Nam là quốc gia có

dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát vào năm 2003 và liên tục tái bùng phát nhiều

đợt dịch ở gia cầm hàng năm tại các địa phƣơng, với hơn 62 ngƣời tử vong trong

tổng số hơn 124 ngƣời đƣợc xác định nhiễm loại virus này. Các trƣờng hợp ngƣời

nhiễm và tử vong bởi virus cúm A/H5N1, đƣợc xác định là do virus xâm nhiễm trực

tiếp sang ngƣời thông qua tiếp xúc với gia cầm bệnh, chất thải ô nhiễm hoặc do sử

dụng các sản phẩm chứa virus từ gia cầm bệnh. Việt Nam cùng với Indonesia và Hy

Lạp, là các quốc gia có tỉ lệ ngƣời nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất

2

trên thế giới, đƣợc xác định là vùng dịch tễ trọng điểm cần quan tâm giám sát, ngăn

chặn, khống chế sự lây truyền của virus ở gia cầm và từ gia cầm sang ngƣời.

Các chủng virus cúm A/H5N1 clade 1, 2 và 7 với sự hình thành nhiều nhánh

clade thuộc 3 genotye Z, V và G, là các nhóm virus lƣu hành phổ biến gây dịch cúm

A/H5N1 ở chim hoang dã, gia cầm và xâm nhiễm gây bệnh với tỉ lệ tử vong cao ở

ngƣời, tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới từ năm 2003 đến nay. Gần đây,

nhóm virus clade 1.1 và đặc biệt là nhóm virus clade 2.3.2.1 hình thành từ năm

2009, có sự thay đổi lớn về kháng nguyên H5, có độc lực cao ở gia cầm và ngƣời

nhiễm so với các nhóm virus lƣu hành trƣớc đó, làm cho vấn đề phòng chống dịch

cho gia cầm và ngăn ngừa virus xâm nhiễm ở ngƣời trở nên phức tạp hơn.

Sự biến đổi của các gen PB2, PB1 và PA là cơ sở giúp virus thích nghi nhân

lên trong tế bào cảm thụ, yếu tố chìa khóa quyết định quá trình lây truyền dễ dàng

giữa ngƣời với ngƣời và gia tăng độc lực của virus ở cơ thể ngƣời, một trong các

vấn đề đƣợc quan tâm nghiên cứu giám sát ở virus cúm A/H5N1 gây bệnh dịch ở

gia cầm và ngƣời hiện nay. Bên cạnh đó, dữ liệu di truyền của các gen PB2, PB1 và

PA cùng với các gen trong hệ gen virus cúm A/H5N1 đƣơng nhiễm, là cơ sở khoa

học cho phép dự báo sớm diễn biến dịch tễ học virus ở mức độ phân tử, nghiên cứu

phát triển vaccine tái tổ hợp và sử dụng vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1

cho ngƣời và gia cầm trong tƣơng lai.

Xuất phát từ cơ sở lí luận và thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm

A/H5N1 đƣơng nhiễm tại Việt Nam”.

Nhằm các mục tiêu:

1- Giải trình tự, so sánh biến đổi đặc tính di truyền, tƣơng đồng về nucleotide

và amino acid các gen PB2, PB1, PA, của một số biến chủng virus cúm A/H5N1

đƣơng nhiễm tại Việt Nam từ năm 2007 – 2011 với các chủng A/H5N1 trên thế giới.

2- Tìm hiểu nguồn gốc phả hệ các gen nói trên của các biến chủng virus cúm

A/H5N1 trong nghiên cứu với các chủng virus A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.

3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A

Virus cúm A (influenza A virus) là nhóm virus thuộc họ Orthomyxoviridae, bộ

Mononegavirales, còn gọi là virus cúm chim (avian influenza virus, AIV) hay virus cúm gia

cầm. Vị trí phân loại của virus cúm A trong hệ thống phân loại cơ sở (Basic Taxonomy) là:

Viruses; ssRNA negative-stranded viruses; Orthomyxoviridae; Influenzavirus A [1], [2], [3].

Nhóm virus cúm A gồm nhiều phân type (subtype), biểu hiện đặc tính kháng

nguyên của hai protein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) gắn trên bề

mặt vỏ capsid hạt virus, cho đáp ứng kháng thể khác nhau của cơ thể nhiễm với mỗi

kháng nguyên này giữa các phân type virus. Cho đến nay, đã phát hiện có 16 phân

type HA (kí hiệu từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) của virus cúm

A lƣu hành ở chim hoang dã. Sự tổ hợp của các phân type HA và NA, có thể dẫn

đến sự hình thành hơn 144 phân type virus cúm A khác nhau lƣu hành trong tự

nhiên. Trong đó, 3 phân type virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2, đã có sự

biến đổi hình thành các chủng virus thích nghi lây truyền dễ dàng trong quần thể

gây ra các đại dịch cúm A ở ngƣời trong lịch sử [1], [2], [3], [4], [5], [6].

Đặc trƣng virus cúm A là kí sinh nội bào bắt buộc, cấu tạo hạt virus đơn giản

với hệ gen là phân tử RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt có khả năng

tự nhân lên trong nhân của tế bào nhiễm. Bên cạnh đó, phức hợp enzym polymerase

của virus cúm A thuộc nhóm enzym RNA phụ thuộc RNA type II, không có cơ chế

đọc-sửa bản sao, tạo nên khả năng đột biến cao trong hệ gen, qua quá trình lây

truyền và lƣu hành gây bệnh của virus ở các loài vật chủ [1], [2], [6].

1.1.1. Cấu tạo chung của virus cúm A

Virus cúm A tồn tại ở dạng các hạt virus (virion) hình cầu hoặc hình khối đa

diện đôi khi có dạng hình sợi, đƣờng kính 80 – 120 nano mét (nm), khối lƣợng phân

tử khoảng 250 triệu dalton (Da). Hạt virus cúm A có cấu tạo đơn giản, bao gồm vỏ

ngoài (envelope), capsid và lõi là vật chất di truyền (hệ gen) của virus [1], [7].

+ Vỏ capsid có chức năng bảo vệ vật chất di truyền của virus cúm A, gồm

hàng trăm đơn vị cấu trúc gọi là capsomer.