Nghiên cứu phân loại một số loài cá thuộc giống cá bỗng (spinibarbus) ở Việt Nam dựa trên gen ty thể (COI, 16S rRNA)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-----------------------------------

NGU N TH TH INH

NGHI N C U PH N OẠI T S O I C THU C

GI NG C NG SPINIBARBUS VI T NA

A TR N G N T TH (COI, 16S rRNA)

UẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGH SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-----------------------------------

NGU N TH TH INH

NGHI N C U PH N OẠI T S O I C THU C

GI NG C NG SPINIBARBUS VI T NA

A TR N G N T TH COI, 16S rRNA)

Chuyên ngành: CÔNG NGH SINH HỌC

ã số: 60 42 02 01

UẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGH SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG ẪN KHOA HỌC

TS KI TH PHƯ NG OANH

THÁI NGUYÊN - 2015

i

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ỜI CẢ N

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, ban chủ nhiệm

Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã

tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến TS. Kim Th Phương

Oanh, trư ng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên c u hệ Gen - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người cô đã dành nhiều thời gian,

tâm huyết, tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và

hoàn thiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, chỉ bảo và giúp đỡ nhiệt tình của

tập th cán bộ Phòng Hệ gen học môi trường - Viện Nghiên c u hệ Gen - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, c ng các cán bộ của các phòng ban

khác, thuộc Viện Nghiên c u hệ Gen đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho

tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

Tôi c ng xin chân thành cảm ơn nhà ngư loại học TS. Nguy n Văn Hảo

và TS. Nguy n Th iệu Phương thuộc Viện Nghiên c u Nuôi tr ng Thủy sản I

c ng anh H nốt - người dân tộc Vân Kiều đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong việc

thu thập và phân loại hình thái các mẫu cá nghiên c u.

Cuối c ng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và tập th lớp Cao học Công

nghệ sinh học K6B đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

và thực hiện luận văn.

Th i Ngu n ng 17 tháng 11 năm 2015

H viên

Nguy n Th Th y inh

ii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ỜI CA ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được trình bày dựa trên kết quả

nghiên c u khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn của chuyên môn của TS.

Kim Th Phương Oanh, trư ng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên c u

hệ Gen, c ng với sự hướng dẫn k thuật của các cán bộ trong phòng Hệ gen học

môi trường. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này là

trung thực, không sao chép t bất c tài liệu, công trình nghiên c u của người

khác mà không chỉ rõ ngu n tham khảo. Tôi xin ch u trách nhiệm về lời cam

đoan của mình trước hội đ ng nhà trường.

Thái Nguyên, ngày 17 tháng 11 năm 2015

H viên

Nguy n Th Th y inh

iii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

C C

ỜI CẢ N........................................................................................................................i

ỜI CA ĐOAN ................................................................................................................ii

C C.............................................................................................................................iii

ANH C C C K HI U C C CH VI T TẮT.......................................... v

ANH C C C ẢNG...............................................................................................vi

ANH C C C H NH...............................................................................................vii

Đ U................................................................................................................................. 1

Chương 1: T NG QUAN T I I U........................................................................... 3

1.1. T ng quan về giống cá ng...................................................................................... 3

1.1.1. V tr phân loại và phân bố.............................................................................. 3

1.1.2. Đ c đi m sinh học............................................................................................. 4

1.1.3. Giá tr kinh tế...................................................................................................... 5

1.2. Nghiên c u phân loại cá .............................................................................................. 5

1.2.1. Khái niệm về hệ thống phân loại cá............................................................. 5

1.2.2. Đ c đi m hình thái thường d ng trong phân loại cá................................ 6

1.2.3. Phân loại học phân t trong phân loại cá.................................................... 6

1.2.4. Tình hình nghiên c u phân loại cá Việt Nam........................................ 9

1.3. Đ c đi m hệ gen ty th và vai trò của gen ty th trong phân loại phân t .... 11

1.3.1. Đ c đi m hệ gen ty th .................................................................................. 11

1.3.2. S d ng gen ty th trong phân loại phân t ............................................. 12

1.3.3. Hệ gen ty th của một số loài thuộc giống cá ng Spinibarbus).... 12

Chương 2: VẬT I U V PHƯ NG PH P NGHI N C U.......................... 14

2.1. Vật liệu........................................................................................................................... 14

2.1.1. Nguyên liệu....................................................................................................... 14

iv

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.1.2. Hóa chất............................................................................................................. 15

2.1.3. Thiết b , d ng c nghiên c u ....................................................................... 16

2.2. Phương pháp nghiên c u ........................................................................................... 17

2.2.1. Phương pháp nghiên c u hình thái............................................................. 17

2.2.2. Phương pháp nghiên c u sinh học phân t ............................................... 17

Chương 3: K T QUẢ NGHI N C U V THẢO UẬN.................................. 27

3.1. Kết quả phân loại về m t hình thái.......................................................................... 27

3.2. Kết quả tách chiết N t ng số .............................................................................. 28

3.3. Kết quả khuếch đại gen 16S rRN và COI b ng k thuật PCR...................... 29

3.4. Kết quả tinh sạch sản ph m PCR............................................................................. 30

3.5. Kết quả giải trình tự gen ............................................................................................ 31

3.5.1. Kết quả giải mã đoạn gen 16S rRN của ba mẫu cá nghiên c u ..... 31

3.5.2. Kết quả giải mã đoạn gen COI của ba mẫu cá nghiên c u................. 34

3.6. Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa trên

đoạn gen 16S rRN và COI.................................................................................... 38

3.6.1. Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa

trên đoạn gen 16S rRN ......................................................................... 38

3.6.2. Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa

trên đoạn gen COI...................................................................................... 43

3.7. Đánh giá t nh hiệu quả của N barcoding s d ng đ phân loại giống

cá ng Spinibarbus) ............................................................................................... 48

K T UẬN V KI N NGH ....................................................................................... 49

T I I U THA KHẢO.............................................................................................. 50

PH C ............................................................................................................................. 56

v

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ANH C C C K HI U C C CH VI T TẮT

COI Cytochrome c Oxidase subunit I

DNA Deoxyribonucleic Acid

bp basepair

dNTP deoxynucleotide triphosphate

ddNTP dideoxynucleotide triphosphate

EDTA Ethylene-Diamine-Tetra-Acetic acid

epp eppendorf

EtBr Ethidium Bromide

Kb Kilobase

K2P Kimura 2-Parameter

mM milliMol

ML Maximum Likelihood

MP Maximum Parsimony

mtDNA mitochondrial DNA

ng nanogram

NJ Neighbour Joining

OD Opitical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

pmol picomol

Primer F Primer Forward

Primer R Primer Reverse

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

TAE Tris base-Acetic acid-EDTA

µl microliter

vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ANH C C C ẢNG

ảng 2.1: Các hóa chất được s d ng................................................................. 15

ảng 2.2: Các thiết b , d ng c được s d ng .................................................... 16

ảng 2.3: Các c p m i s d ng trong nghiên c u .............................................. 19

ảng 2.4: Thành phần phản ng PCR................................................................. 22

ảng 3.1: ảng kết quả xác đ nh n ng độ và O 260/280 N t ng số của các

mẫu cá nghiên c u ............................................................................... 28

ảng 3.2: ảng kết quả xác đ nh n ng độ và O 260/280 sản ph m PCR của

các mẫu cá nghiên c u sau khi đã được tinh sạch............................... 30

ảng 3.3: ảng thống kê một phần kết quả L ST đối với đoạn gen 16S

rRN của ba mẫu nghiên c u.............................................................. 32

ảng 3.4: ảng thống kê một phần kết quả L ST đối với đoạn gen COI

của ba mẫu nghiên c u ........................................................................ 35

ảng 3.5: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền một số

node trên cây phát sinh chủng loại Hình 3.4 cho sự phân tách rõ

các loài trong c ng một giống ............................................................. 41

ảng 3.6: Khoảng cách di truyền K2P gi a các loài cá nghiên c u và 4 loài

thuộc giống cá ng đã được đ nh danh trên Gen ank t bộ d

liệu trình tự đoạn gen 16S rRNA......................................................... 42

ảng 3.7: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền một số

node trên cây phát sinh chủng loại Hình 3.5 cho sự phân tách rõ

các loài trong c ng một giống ............................................................. 46

ảng 3.8: Khoảng cách di truyền K2P gi a các loài cá nghiên c u và 4 loài

thuộc giống cá ng đã được đ nh danh trên Gen ank t bộ d

liệu trình tự đoạn gen COI................................................................... 46