Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô của vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện hòa vang - thành phố đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG

LÊ TRẦN DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ TẠO

CHẾ PHẨM THÔ CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME

PHYTASE TỪ ĐẤT THUỘC ĐỊA BÀN HUYỆN

HÒA VANG – THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Đà Nẵng - năm 2018

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô

của vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện Hòa Vang- thành

phố Đà Nẵng” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu nghiên cứu, kết quả điều tra, kết quả phân tích trung thực, chƣa

từng đƣợc công bố. Các số liệu liên quan đƣợc trích dẫn có ghi chú nguồn gốc, đã

công bố theo đúng quy định.

Đà Nẵng, tháng 05 năm 2018

Lê Trần Diệu Linh

ii

LỜI CẢM ƠN

Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô PGS.TS Đỗ Thu Hà

ngƣời đã luôn quan tâm và tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh

nghiệm quý báu cho em trong quá trình thực hiện khóa luận.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa -Môi trƣờng - Đại học Sƣ Phạm￾Đại học Đà Nẵng đã quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất có thể giúp cho em hoàn

thành khóa luận.

Cuối cùng, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và anh chị

khóa trên đã luôn nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian

làm khóa luận.

Xin chân thành cảm ơn!

Lê Trần Diệu Linh

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii

MỤC LỤC................................................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................v

DANH MỤC HÌNH ẢNH .........................................................................................vi

DANH MỤC BẢNG............................................................................................... viii

MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1

1. ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................................................1

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU....................................................................................2

3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI .....................................2

CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................3

1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE...........................................................................3

1.2. ENZYME PHYTASE ..........................................................................................4

1.2.1. Nguốc gốc enzyme phytase ..............................................................................6

1.2.2. Đặc điểm enzyme phytase ................................................................................7

1.2.3. Ứng dụng của enzyme phytase .........................................................................9

1.3. LÊN MEN XỐP .................................................................................................12

1.3.1. Khái niệm lên men xốp ...................................................................................12

1.3.2. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của kỹ thuật lên men xốp ........................................12

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở

VIỆT NAM ...............................................................................................................13

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới..................................................................13

1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ................................................................14

1.5. ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC

PHÂN TỬ .................................................................................................................15

1.6. ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU.......................................16

1.6.1. Địa hình và đất đai ..........................................................................................16

1.6.2. Đặc điểm khí hậu và thổ nhƣỡng ....................................................................16

CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...17

2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ..............................................................................17

2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..............................................................................17

iv

2.2. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ................................17

2.2.1. Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa ....................................................................17

2.2.2. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu thí nghiệm..................................................17

2.2.3. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................18

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................18

2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và xử lí mẫu đất...........................................................18

2.3.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật có khả năng sinh phytase ngoại bào .........19

2.3.3. Phƣơng pháp xác định mật độ vi sinh vật (theo phƣơng pháp Koch) ............20

2.3.4. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme phytase .............................................21

2.3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái các chủng tuyển

chọn .........................................................................................................................23

2.3.6. Giữ giống VSV ...............................................................................................24

2.3.7. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử....................................24

2.3.8. Phƣơng pháp tạo chế phẩm enzyme phytase ..................................................27

CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.............................................................32

3.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE........32

3.3. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ NUÔI CẤY CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT

SINH ENZYME PHYTASE TUYỂN CHỌN..........................................................38

3.4. ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE

ĐƢỢC TUYỂN CHỌN ............................................................................................44

3.4.1. Nhân trình tự gen 18S rRNA của các mẫu nấm NM1 và NM4......................44

3.4.2. Giải trình tự và lập cây phân loại....................................................................45

3.5. KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ

NĂNG SINH ENZYME PHYTASE TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN XỐP.......46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................57

1. KẾT LUẬN...........................................................................................................57

2.KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................58

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................59

v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU : Colony Foming Unit (Đơn vị khuẩn lạc)

CT : Công thức

KL : Khuẩn lạc

KLTB : Khối lƣợng trung bình

HSCC : Hệ sợi cơ chất

HSKS : Hệ sợi khí sinh

MT : Môi trƣờng

NM : Nấm mốc

STT : Số thứ tự

TB : Trung bình

TP : Thành phố

VK : Vi khuẩn

VSV : Vi sinh vật

PSM : Phytase screening media

vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Số hiệu

hình

Tên hình Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của inositol 3

Hình 1.2 Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein 3

Hình 1.3 Phản ứng xúc tác của enzyme phytase 5

Hình 2.1 Mối tƣơng quan giữa nồng độ K2HPO4 với OD 23

Hình 2.2. Chu trình gia nhiệt chƣơng trình chạy PCR 25

Hình 2.3.

Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm enzyme

phytase

28

Hình 3.1.

Một số chủng nấm mốc phân lập đƣợc trên môi trƣờng

PSM

35

Hình 3.2.

Một số chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng

PSM

35

Hình 3.3

Tỉ lệ % các chủng vi khuẩn, nấm mốc có khả năng sinh

phytase mạnh

37

Hình 3.4.

Hình ảnh phân giải acid phytate của VK-1 và VK-4 trên

môi trƣờng PSM

38

Hình 3.5.

Hình ảnh phân giải acid phytate của NM-1 và NM-4 trên

môi trƣờng

38

Hình 3.6. Khuẩn lạc và hình thái tế bào vi khuẩn VK-1 39

Hình 3.7.

Chủng nấm mốc NM-1trên môi trƣờng PDA và Cơ quan

sinh sản của chủng nấm mốc NM-1 dƣới kính hiển vi 41

Hình 3.8.

Chủng nấm mốc NM-4 trên môi trƣờng và cơ quan sinh

sản của chủng nấm mốc NM-4 dƣới kính hiển vi 42

Hình 3.9. Dịch nuôi cấy lỏng qua 120 giờ nuôi cấy 43

Hình 3.10.

Thu dịch lỏng nuôi cấy các chủng tuyển chọn qua thời

gian nuôi cấy 44

Hình 3.11. Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của 44

vii

mẫu NM1

Hình 3.12

Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của

mẫu NM4

45

Hình 3.13

Giản đồ phả hệ chủng nấm NM1, NM4 và một số chủng

nấm khác

45

Hình 3.14 Giống cấp 2 chủng VK-1 sau 3 ngày nuôi cấy dịch thể 47

Hình 3.15 Sơ đồ quy trình lên men xốp chủng vi khuẩn VK-1 47

Hình 3.16

Khảo cơ chất thích hợp cho lên men xốp chế phẩm

phytase thô

48

Hình3.17

Khảo sát cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng vi

khuẩn VK-1

49

Hình 3.18.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme

phytase của chủng VK-1 tuyển chọn

51

Hình 3.19.

Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme

phytase trên môi trƣờng xốp của chủng VK-1.

53

Hình 3.20.

Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng

thích hợp

54

Hình 3.21.

Ảnh hƣởng pH đến khả năng sinh hoạt tính enzyme

phytasecủa cung VK-1

55