Nghiên cứu phân lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính Gelatinaza và Xenlulaza gặp trong môi trường đất khu vực vườn Bách Thảo - Hà Nội

1

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN VĂN BẮC

Nghiªn cøu Ph©n lËp, ph©n lo¹i, b¶o qu¶n

mét sè chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh gelatinaza

vμ xenlulaza gÆp trong m«i tr−êng ®Êt

khu vùc v−ên b¸ch th¶o - Hμ Néi

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

Người hướng dẫn : TS. Lại Văn Hòa

Hà Nội - 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng

tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Lại Văn Hòa. Các số liệu và

kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực có

nguồn gốc rõ ràng.

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Bắc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3

MôC LôC

Æt vÊn ®Ò................................................................................................................. 1

Ch−¬ng 1: Tæng quan tµi liÖu ...................................................................... 3

1.1. VÞ trÝ cña nÊm trong sinh giíi........................................................ 3

1.2. TÝnh ®a d¹ng cña vi nÊm................................................................ 4

1.3. Vi nÊm trong ®Êt............................................................................ 5

1.4. Vai trß cña vi nÊm trong c«ng nghiÖp ........................................... 7

1.5. §Æc tÝnh ®Æc tr−ng cña vi nÊm....................................................... 8

1.6. HÖ thèng ph©n lo¹i vi nÊm............................................................. 9

1.6.1. HÖ thèng ph©n lo¹i cña Robert Shaffer (1969)........................... 9

1.6.2. HÖ thèng cña Ainsworth & Bisby (1995)................................... 10

1.7. Nh÷ng vÊn ®Ò chung vÒ c¬ chÕ sinh ho¸ vµ sù ph¸ huû sinh häc

do vi nÊm g©y nªn......................................................................... 12

1.7.1. §Æc ®iÓm ph¸ huû sinh häc do vi nÊm ....................................... 12

1.7.2. C¸c chÊt trao ®æi chuyÓn ho¸ x©m thùc cña sîi nÊm - c¸c lo¹i

enzym vµ c¸c axÝt h÷u c¬ ............................................................. 13

1.8. C¸c ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n vi nÊm................................................ 16

1.8.1. Nhãm ph−¬ng ph¸p tiÕp tôc duy tr× sù ph¸t triÓn ...................... 19

1.8.2. Nhãm ph−¬ng ph¸p lµm kh« ...................................................... 20

1.8.3. Nhãm ph−¬ng ph¸p lµm ®×nh chØ trao ®æi chÊt .......................... 22

1.9. Lùa chän c¸c ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n ............................................ 25

1.10. Nh÷ng nghiªn cøu vÒ ph©n lo¹i vµ b¶o qu¶n vi nÊm ë ViÖt Nam.... 26

Ch−¬ng 2: §èi t−îng, vËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu ......... 28

2.1. §èi t−îng nghiªn cøu .................................................................... 28

2.2. VËt liÖu nghiªn cøu........................................................................ 28

2.2.1. Dông cô, thiết bị ......................................................................... 28

2.2.2. M«i tr−êng nu«i cÊy ................................................................... 29

2.2.3. Ho¸ chÊt vµ c¸c c¬ chÊt sinh häc................................................ 29

2.3. Ph−¬ng ph¸p vµ kü thuËt nghiªn cøu............................................. 30

2.3.1. Ph−¬ng ph¸p lÊy mÉu ................................................................. 30

2.3.2. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp................................................................. 30

2.3.3. Ph−¬ng ph¸p ph©n lo¹i vi nÊm ................................................... 30

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

4

2.3.4. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu mét sè ®Æc ®iÓm sinh häc cña vi nÊm 33

2.3.5. Ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n c¸c chñng nÊm sîi................................. 34

2.3.6. Ph−¬ng ph¸p phôc håi ................................................................ 35

Ch−¬ng 3: KÕt qu¶ nghiªn cøu..................................................................... 36

3.1. KÕt qu¶ ph©n lËp vµ ph©n lo¹i c¸c chñng vi nÊm tõ m«i tr−êng

®Êt khu vùc v−ên B¸ch Th¶o ........................................................ 36

3.1.1. Thành phần chủng loại vi nÊm trong ®Êt v−ên B¸ch Th¶o......... 36

3.1.2. §Æc ®iÓm ph©n lo¹i h×nh th¸i cña c¸c chi vi nÊm ph©n lËp ®−îc 40

3.2. Lùa chän c¸c chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh enzym ph©n hñy c¬

chÊt gelatin vµ xenluloza ph©n lËp tõ m«i tr−êng khu vùc v−ên

B¸ch Th¶o ®−a vµo b¶o qu¶n........................................................ 57

3.3. KÕt qu¶ phôc håi cña c¸c chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh enzym ph©n

lËp tõ m«i tr−êng ®Êt khu vùc v−ên B¸ch Th¶o – Hµ Néi sau khi

b¶o qu¶n trong glyxerin 10%, -200C vµ trªn silicagel................. 59

3.4. Kh¶ sinh enzym ph©n huû c¬ chÊt sinh häc cña c¸c chñng nÊm sîi

ph©n lËp ®−îc tõ m«i tr−êng ®Êt v−ên B¸ch Th¶o sau b¶o qu¶n 18

th¸ng.............................................................................................. 66

Ch−¬ng 4: Bµn LuËn ........................................................................................... 73

4.1. Ph©n lËp, ph©n lo¹i c¸c chñng vi nÊm tõ m«i tr−êng ®Êt khu vùc

v−ên B¸ch Th¶o............................................................................ 73

4.2. Lùa chän c¸c chñng vi nÊm cã ho¹t tÝnh enzym ph©n huû 2 c¬

chÊt sinh häc (xenluloza, gelatin) ®Ó ®−a vµo b¶o qu¶n............... 75

4.3. B¶o qu¶n c¸c chñng vi nÊm cã ho¹t tÝnh enzym ®· ®−îc chän b»ng

hai ph−¬ng ph¸p: l¹nh s©u (glyxerin 10% ë -200C) vµ trªn silicagel. 76

4.4. Kh¶ n¨ng sinh enzym ph©n huû c¸c c¬ ch¾t sinh häc cña c¸c

chñng nÊm sîi phôc håi sau b¶o qu¶n.......................................... 77

Ch−¬ng 5: KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ................................................................ 79

TµI LIÖU THAM KH¶O ........................................................................................... 81

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

5

C¸c ch÷ viÕt t¾t

ATCC American Type Culture Colletion

CCRC Culture Collection Research Center

IMI International Mycological Institute

LS Lạnh sâu

SLC Silicagel

TBQ Trước bảo quản

SBQG Sau bảo quản glyxerin

SBQS Sau bảo quản Silicagel

DMSO Dimethyl sulfoxide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1

§Æt vÊn ®Ò

Nấm (Fungi) lµ một giới sinh vật phổ biến trong tự nhiên. Chóng cã thÓ

sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn ë kh¾p mäi n¬i, trªn mäi lo¹i c¬ chÊt víi tèc ®é ph¸t

triÓn nhanh, m¹nh. §a phần các nấm đều không thể nhìn thấy được bằng mắt

thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh

hoặc kí sinh trên cơ thể động thực vật và nấm khác. Một số loài nấm có thể nhận

thấy được khi ở dạng thể quả, như nấm lớn và nấm mốc.

Người ta ước tính giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài, khoảng 70.000 loài

nấm đã được các nhà phân loại học phát hiện và miêu tả, tuy nhiên tính đa dạng

của giới Nấm vẫn còn là điều bí ẩn [29]. Các loài nấm hoại sinh đóng vai trò

quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất và năng lượng trong tự nhiên. Nấm

có thể phân giải các chất hữu cơ phức tạp thành các chất đơn giản, đặc biệt là các

chất khó phân giải như xenluloza, ligin thành chất vô cơ. Do đó, nó là yếu tố

quan trọng làm tăng độ phì nhiêu của đất. Nấm có ý nghĩa rất quan trọng trong

đời sống của con người, chúng có vai trò thực tiễn trong kinh tế, khoa học và các

chu trình vật chất, năng lượng trong tự nhiên [30]. Nhiều loài nấm được sử dụng

trong công nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc các sản phẩm của quá trình

lên men... Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích to lớn đó, nhiều loại nấm lại gây bệnh

cho người, động thực vật [32]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khu hệ vi nấm

trong môi trường không khí tự nhiên, trên các sản phẩm công-nông nghiệp khác

nhau, trong dược phẩm, trong đất,... nhưng với số lượng chưa nhiều.

Ở nước ta, khí hậu nhiệt đới ẩm rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều

loại vi nấm, chúng phong phú cả về số lượng và thành phần chủng loại. Để góp

phần khảo sát sự đa dạng về thành phần chủng loại, đặc tính sinh học và tìm

kiếm các chủng vi nấm mới chưa được phát hiện ở Việt Nam nói chung và ở môi

trường đất nói riêng, trong luận văn này chóng t«i tiến hành‘‘ Nghiªn cøu ph©n

lËp, ph©n lo¹i, b¶o qu¶n mét sè chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh gelatinaza vµ

xenlulaza gÆp trong m«i tr−êng ®Êt khu vùc V−ên Bách thảo-Hà Nội’’.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2

Mục tiêu của chúng tôi đưa ra là:

1. Phân lập, phân loại một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelainaza và

xenlulaza gặp trong môi trường đất khu vực Vườn Bách thảo-Hà Nội

2. B¶o qu¶n c¸c chñng vi nÊm ®· ph©n lËp ®ưîc b»ng mét sè phư¬ng ph¸p

b¶o qu¶n hiÖn nay

3. Gãp phÇn x©y dùng bé sưu tËp c¸c chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh enzym

phôc vô cho c¸c nghiªn cøu vµ vµo bé sưu tËp gièng cña B¶o tµng gièng chuÈn

ViÖt Nam.

Néi dung nghiªn cøu

1. Ph©n lËp c¸c chñng nÊm sîi tõ m«i tr−êng ®Êt khu vùc v−ên B¸ch Th¶o

2. Ph©n lo¹i x¸c ®Þnh ®Õn chi, loµi c¸c chñng nÊm sîi ®· ph©n lËp ®−îc.

3. X¸c ®Þnh ho¹t tÝnh enzym ph©n huû mét sè c¬ chÊt sinh häc nh−

gelatin, xenluloza cña c¸c chñng nÊm sîi ®· ph©n lËp vµ ph©n lo¹i.

4. B¶o qu¶n c¸c loµi nÊm sîi cã ho¹t tÝnh enzym cao b»ng ph−¬ng ph¸p

silicagel vµ b¶o qu¶n trong glyxerin 10% ë nhiÖt ®é -200

C.

5. Phôc håi c¸c chñng vi nÊm ®· b¶o qu¶n sau 18 th¸ng, kiÓm tra ®é

thuÇn khiÕt, ®é sèng sãt, ®é æn ®Þnh vÒ h×nh th¸i vµ kh¶ n¨ng sinh enzym

ph©n huû c¬ chÊt sinh häc cña chóng.

6. X©y dùng bé s−u tËp c¸c chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh enzym phôc vô

cho c¸c nghiªn cøu vµ gãp phÇn vµo bé s−u tËp gièng cña B¶o tµng gièng

chuÈn ViÖt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3

Ch−¬ng 1

Tæng quan tμi liÖu

1.1. VÞ trÝ cña nÊm trong sinh giíi

Tr−íc ®©y, nÊm ®−îc xÕp vµo mét ngµnh (Mycota) cña d−íi giíi thùc

vËt bËc thÊp. HiÖn nay nÊm kh«ng cßn ®−îc xem lµ mét ngµnh cña d−íi giíi

thùc vËt bËc thÊp, mµ nÊm lµ mét giíi riªng biÖt trong thÕ giíi sinh vËt. Theo

Takhtajan (1973): “Kh«ng cã c¬ së nµo ®¸ng kÓ ®Ó xÕp nÊm vµo thùc vËt”. Vi

nÊm cã hµng lo¹t c¸c ®Æc ®iÓm riªng biÖt sau đây:

- Dinh d−ìng: NÊm kh«ng dinh d−ìng theo kiÓu quang hîp nh− thùc

vËt hoÆc b»ng kiÓu nuèt thøc ¨n nh− ®éng vËt. NÊm dÞ d−ìng b»ng c¸ch hÊp

thô hay thÈm thÊu. NÊm hÊp phô c¸c chÊt dinh d−ìng b»ng c¸ch tiÕt ra ngoµi

m«i tr−êng các enzym ®Ó ph©n gi¶i c¸c chÊt cã cÊu tróc phøc t¹p thµnh những

chÊt cã cÊu tróc ®¬n gi¶n sau ®ã hÊp phô qua mµng.

- CÊu tróc tÕ bµo: C¸c nÊm thËt (Eumycota) cã thµnh phÇn ho¸ häc cña

v¸ch tÕ bµo lµ kitin (thùc vËt cã v¸ch tÕ bµo lµ xenluloza).

- Sinh ho¸: ChÊt dù tr÷ cña nÊm lµ glycogen gièng nh− ë ®éng vËt còn ở

thùc vËt cã chÊt dù tr÷ lµ tinh bét. Ngoµi ra, nÊm cßn h×nh thµnh c¸c s¶n phÈm

gièng víi ®éng vËt nh− c¸c axít amin.

- Ph−¬ng thøc sèng: NÊm dÞ d−ìng b»ng c¸ch hÊp thô, ®éng vËt dÞ

d−ìng b»ng c¸ch nuèt thøc ¨n, thùc vËt dÞ d−ìng b»ng c¸ch quang hîp.

- C¸ thÓ ph¸t sinh: Trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn c¸ thÓ c¸c nÊm tiÕn ho¸

cao th× cã giai ®o¹n song h¹ch (ở nấm túi vµ nấm đảm), giai ®o¹n song h¹ch

kh«ng cã ë c¸c sinh vËt kh¸c.

- C¬ thÓ dinh d−ìng: Sîi ph©n nh¸nh t¹o thµnh hÖ sîi nÊm, nhưng ở

thùc vËt cã c¬ thÓ dinh d−ìng d¹ng c©y cã rÔ, th©n, l¸.

- Sinh s¶n: NÊm sinh s¶n vµ ph¸t t¸n b»ng bµo tö.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn