Nghiên Cứu Phân Lập Gen 4 Cl 1 Mã Hóa Cho 4 Coumarate Coenzyme A Ligase 1 Từ Cây Thông Mã Vĩ Pimus Massoniana L Và Biểu Hiện Ở Vi Khuẩn Escherichia Coli

1

Tr-êng ®¹i häc l©m nghiÖp

Khoa l©m häc

--------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Nghiªn cøu ph©n lËp gen 4CL1 m· ho¸ cho

4-Coumarate Coenzyme A Ligase 1 tõ c©y Th«ng M· VÜ (Pinus

massoniana L.) vµ biÓu hiÖn ë vi khuÈn Escherichia coli

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã ngành : 307

Gi¸o viªn h-íng dÉn: ThS. Bïi V¨n Th¾ng

: ThS. Hµ V¨n Hu©n

Sinh viªn thùc hiÖn : Vò ThÞ Lîi

Khãa häc : 2005 - 2009

Hµ Néi – 2009

2

ĐẶT VẤN ĐỀ

Công nghệ gen đang là một hƣớng đi mới cho các nhà tạo giống cây

trồng, khi diện tích đất trồng cây ngày càng bị thu hẹp do quá trình đô thị hoá

diễn ra ngày càng mạnh mẽ. Cây lâm nghiệp biến đổi gen cũng theo đà phát

triển này lớn mạnh từng ngày. Từ năm 2004, đã có rất nhiều quốc gia đƣa cây

lâm nghiệp biến đổi gen vào trồng thƣơng mại hoá điển hình nhƣ Hoa Kỳ và

Trung Quốc, những quốc gia đi tiên phong trong lĩnh vực công nghệ sinh học

lâm nghiệp. Khi đƣa công nghệ gen ứng dụng vào cây lâm nghiệp, các nhà

khoa học thƣờng quan tâm tới các đặc tính nhƣ: tốc độ sinh trƣởng, chất

lƣợng gỗ, khả năng chống chịu sâu bệnh hại và chống chịu lại các điều kiện

bất lợi của môi trƣờng. Cải thiện chất lƣợng gỗ là mối quan tâm hàng đầu của

các nhà nghiên cứu, với hơn 57% tổng số các công trình nghiên cứu về cây

lâm nghiệp biến đổi gen liên quan đến tính trạng này.

Từ thập niên 90 trở lại đây, nhiều công trình nghiên cứu về việc thay đổi

hàm lƣợng lignin trong cơ thể thực vật đã đƣợc ứng dụng vào trong thực tế

sản xuất. Các nghiên cứu này chủ yếu dựa vào việc kích thích sự hoạt động

của nhóm gen 4CL, có khả năng ảnh hƣởng đến việc sinh tổng hợp lignin

trong cơ thể thực vật. Gen 4CL1 mã hóa cho enzym 4- Coumarate Coenzyme

A Ligase 1 kích thích sinh tổng hợp lignin làm cho cấu trúc mạch gỗ của cây

bền vững hơn, chịu đƣợc các tác nhân lý - hoá học tác động từ môi trƣờng bên

ngoài và là gen đang đƣợc quan tâm nhiều nhất.

Thực tế trên đã khẳng định, việc phân lập thành công gen mục tiêu 4CL1

từ đối tƣợng thực vật và biểu hiện đƣợc gen 4CL1 trong hệ thống biểu hiện

prokaryot là vô cùng cần thiết cho các nghiên cứu về chuyển gen cây lâm

nghiệp làm tăng chất lƣợng gỗ. Với mục tiêu cuối cùng là chuyển gen 4CL1

vào cây trồng lâm nghiệp, gen 4CL1 cần phải là nguồn gen đáng tin cậy và có

thể tạo ra sản phẩm chức năng.

3

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên

cứu phân lập gen 4CL1 mã hoá cho 4 - Coumarate Coenzyme A Ligase 1

từ cây Thông Mã Vĩ (Pinus massoniana L.) và biểu hiện ở vi khuẩn

Escherichia coli” làm nền tảng cho quá trình chuyển gen 4CL1 vào cây trồng

lâm nghiệp. Đây là một phần nội dung đƣợc thực hiện của đề tài “Nghiên cứu

tạo giống Xoan ta (Malia azadarach L.) biến đổi gen có tốc độ sinh trƣởng

nhanh, chất lƣợng gỗ tốt”.

Với mục tiêu:

- Phân lập và xác định đƣợc trình tự nucleotid gen 4CL1 phân lập từ cây

Thông Mã Vĩ.

- Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện gen 4CL1.

- Tạo chủng vi khuẩn E.coli mang vector biểu hiện tái tổ hợp đã đƣợc

chèn gen quan tâm 4CL1.

4

Chƣơng 1

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Tổng quan về phân lập gen

1.1.1. Vai trò của cây trồng biến đổi gen

Trƣớc đây, để tạo ra một giống mới các nhà tạo giống thƣờng sử dụng

phƣơng pháp lai để tổ hợp gen giữa hai cá thể bố mẹ tạo ra cơ thể con lai.

Tuy nhiên, phép lai chéo này chỉ có thể thực hiện đƣợc giữa những cá thể

cùng loài và gặp rất nhiều khó khăn. Công nghệ gen ra đời đã tạo ra một

cuộc cách mạng trong công tác tạo giống mới với hàng loạt giống cây

trồng, vật nuôi và vi sinh vật mang những đặc tính mong muốn vƣợt qua

đƣợc giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống (Lê Duy Thành, 2001).

Cây trồng biến đổi gen GMC (Genetically Modified Crop) là những

giống cây trồng có vật chất di truyền đƣợc biến đổi theo mục tiêu phục vụ

lợi ích của con ngƣời (Vũ Văn Vụ, 2005).

Từ năm 1996, cây trồng biến đổi gen đã đƣợc đƣa vào canh tác đại trà

(James, 2005). Đánh giá tổng kết của FAO năm 2007 cho thấy, diện tích

cây trồng CNSH liên tục tăng ở mức cao (gồm 12 nƣớc đang phát triển và

11 nƣớc công nghiệp) mang lại nhiều lợi ích về kinh tế và môi trƣờng

(FAO, 2007). Hiện nay có tới 674 sản phẩm cây trồng CNSH đã đƣợc 53

chính phủ phê chuẩn có mặt trên thị trƣờng từ tháng 11 năm 2007

(http://www.biotechnology.com.vn).

Trung Quốc là quốc gia đông dân cƣ nhất trên thế giới không những

cam kết trồng cây CNSH mà còn là quốc gia tiên phong trong việc đƣa cây

lâm nghiệp biến đổi gen vào trồng thƣơng mại hóa (FAO, 2004)s. Tiến

hành các nghiên cứu về cây lâm nghiệp biến đổi gen thƣờng theo hai hƣớng

chính là tăng tốc độ sinh trƣởng (chiếm 6%) và cải thiện chất lƣợng gỗ

(chiếm 57%) nhằm nâng cao giá trị kinh tế trên một đơn vị diện tích trồng

rừng (FAO, 2004).

5

Do yêu cầu về chất lƣợng gỗ với mục đích sử dụng là khác nhau, cần

loại gỗ có hàm lƣợng lignin khác nhau vì vậy mà các nhà tạo giống hiện

nay đang đi vào hƣớng cải thiện chất lƣợng gỗ của cây lâm nghiệp.

Cải thiện chất lƣợng gỗ là làm tăng hoặc giảm hàm lƣợng lignin trong

cơ thể thực vật để phù hợp với mục tiêu của con ngƣời. Cả hai hƣớng

nghiên cứu này đều tập trung tác động vào cơ chế điều hòa hoạt tính của

enzym chìa khóa liên quan trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp lignin. Để

đạt đƣợc mục đích đó, các nhà khoa học đã ứng dụng công nghệ chuyển

gen để tạo ra giống mới mang các đặc tính mong muốn.

1.1.2. Tổng quan về nghiên cứu tách dòng gen

Tách dòng gen (gene cloning) còn đƣợc gọi với nhiều tên khác nhau:

tạo dòng gen, nhân dòng gen, phân lập gen,…

SƠ ĐỒ TÁCH DÒNG GEN

Vector tách dòng Gen mục tiêu

RNA tổng số

mRNA

Vi khuẩn E.coli

tách dòng

Vector tách dòng tái tổ hợp

Vi khuẩn E.coli mang

vector tái tổ hợp

Sàng lọc gen

Phân tích trình tự

nucleotid