Nghiên cứu một số dặc tính sinh học của vi khuẩn salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy và chế tạo vaxin phòng bệnh

Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o

tr−êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi

----------
----------

VĂN THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN

SALMONELLA PHÂN LẬP ðƯỢC TỪ LỢN SAU CAI SỮA BỊ

TIÊU CHẢY VÀ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN PHÒNG BỆNH

LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp

Chuyªn ngµnh : THó Y

M· sè : 60.62.50

Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ

Hµ Néi - 2009

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số

liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố

trong bất kì công trình nào khác.

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã

ñược chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, Ngày tháng 9 năm 2009

Tác giả

Văn Thị Hường

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân,

tôi xin ñược ñặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS.TS. Cù Hữu

Phú, người ñã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn

thành luận văn.

Tôi xin ñược chân thành cảm ơn tới thầy: TS. Nguyễn Hữu Nam, các

thầy cô trong bộ môn Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y;

Viện sau ðại học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ

và tạo mọi ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn tới các chuyên gia: GS. Koichi

Takeshi, GS. Makino Sou-ichi, Khoa Thú y ứng dụng và sức khỏe cộng ñồng￾Trường ðại học Nông nghiệp và Thú y Obihiro, Nhật Bản ñã giúp tôi trong

quá trình thực hiện ñề tài.

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh ñạo Viện Thú y, các anh, chị, em Bộ môn Vi

trùng- Viện Thú y, Lãnh ñạo công ty giống chăn nuôi Hà Nôi, Hưng Yên, Bắc

Ninh, Hải Phòng, Thái Bình và các bạn ñồng nghiệp ñặc biệt là gia ñình ñã

tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận

văn này.

Hà nội, ngày tháng 09 năm 2009

Văn Thi Hường

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các từ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

1. ðẶT VẤN ðỀ 1

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra 3

2.2 Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn Salmonella 9

2.3 Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn 22

2.4 Biện pháp phòng trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn 28

2.5 Một số hiểu biết về vacxin và vacxin phòng bệnh Phó thương hàn 29

3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 Nội dung nghiên cứu 32

3.2 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 33

3.3 Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu 33

3.4 Phương pháp nghiên cứu 34

3.5 Phương pháp sử lý số liệu 44

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella 46

4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm 46

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv

4.1.2 Kết quả xác ñịnh tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella ở một số cơ

quan phủ tạng của lợn bệnh 48

4.2 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính nuôi cấy và sinh hóa của các

chủng Salmonella phân lập ñược 53

4.3 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella

phân lập ñược 57

4.4 Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm của các chủng Salmonella phân

lập ñược với một số loại kháng sinh 61

4.5 Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn

Salmonella phân lập ñược 64

4.6 Kết quả xác ñịnh ñộc lực của một số chủng vi khuẩn Salmonella

phân lập ñược trên chuột nhắt trắng 69

4.7 Kết quả gây bệnh thực nghiệm trên lợn bằng các chủng

Salmonella phân lập ñược 72

4.8 Kết quả chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh Salmonella cho lợn 76

4.8.1 Chế vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Salmonella

cho lợn 76

4.8.2 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực vacxin trên chuột thí nghiệm. 79

5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 81

5.1 Kết luận 81

5.2 ðề nghị 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADP Adenosine DiPhosphate

ATP Adenosine TriPhosphate

BHI Brain Heart Infusion

BPW Buffered Pepton Water

CHO Chinese Hamster Ovary Cell

CIRAD Centre de Cooperation Internationale en Recherche

Agronomique pour le Developpement

DHL Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose

DNA DeoxyriboNucleic Acid

DPF Delayer Permebility Factor

DT104 Definitive phage Type 104

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

ETEC EnteroToxigenic E. coli

GDP Guanin DiPhosphate

GTP Guanin TriPhosphate

InvA Invasion A

LIM Lysine Indole Motility

LPS LipoPolySaccharide

LT Heat- Labile Toxin

mARN Messenger Acide RiboNucleotide

RPF Rapid Permebility Factor

ST Heat- stabile Toxin

Stn Salmonella toxin

TSI Triple- Sugar- Iron

PCR Polymerase Chain Reaction

RV Rappaports Vassiliadis

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi

DANH MỤC BẢNG

STT Tªn b¶ng Trang

3.1 Bảng ñánh giá mức ñộ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại

kháng sinh 41

3.2 Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm dùng ñể xác ñịnh một

số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ñược 42

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các mẫu phân và phủ tạng 47

4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở một số cơ quan phủ tạng

của lợn bệnh 49

4.3 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi

khuẩn Salmonella phân lập ñược 53

4.4 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng vi

khuẩn Salmonella phân lập ñược 55

4.5 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân

lập ñược 60

4.6 Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm với một số loại kháng sinh của

các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 63

4.7 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn

Salmonella phân lập ñược 66

4.8 Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng Salmonella phân lập ñược 71

4.9 Các chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh 72

4.10 Kết quả gây bệnh thực nghiệm Salmonella trên lợn 35 ngày tuổi 73

4.11 Bệnh tích ñại thể các lợn gây bệnh thực nghiệm 75

4.12 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin 78

4.13 Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 79

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

3.1 Quy trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella từ các

mẫu phân và phủ tạng 36

3.2 Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn 45

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Sallmonella từ mẫu phân và phủ tạng 47

4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở một số cơ quan phủ

tạng của lợn bệnh 49

4.3 Ruột lợn bi viêm do vi khuẩn Salmonella gây ra. 52

4.4 Lách sưng to ở lợn mắc bệnh do Salmonella gây ra. 52

4.5 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường CHROM 56

4.6 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường DHL 56

4.7 Phản ứng lên men ñường của vi khuẩn Salmonella 57

4.8 Vi khuẩn Salmonella trên môi trường TSI 57

4. 9 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella

phân lập ñược 60

4.10 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi

khuẩn Salmonella phân lập ñược 67

4.11 Kết quả của phản ứng PCR xác ñịnh yếu tố gây bệnh của các

chủng vi khuẩn Salmonella 67

4.12 Gây bệnh thực nghiệm cho lợn 76

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1

1. ðẶT VẤN ðỀ

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Trong những năm gần ñây, nền kinh tế nước ta ñã và ñang có những

bước phát triển vượt bậc về mọi mặt, ñời sống kinh tế xã hội ngày càng ñược

cải thiện. ðóng góp một phần không nhỏ cho sự thành công ñó phải kể ñến

các thành tựu của ngành nông nghiệp, trong ñó có ngành chăn nuôi thú y mà

ñặc biệt là ngành chăn nuôi lợn. Ngành chăn nuôi lợn ñã góp phần ñáp ứng

nhu cầu thực phẩm trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ.

Theo CIRAD (2006)[43], thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu

dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam.

Tuy nhiên, một thách thức không nhỏ ñối với việc phát triển chăn nuôi

lợn là dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra trên các ñàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm

giảm năng suất, giảm chất lượng con giống hoặc nhiễm vào sản phẩm thịt lợn

gây nguy cơ mất an toàn vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường

gặp phải kể ñến là bệnh tiêu chảy do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai

sữa, còn gọi là bệnh Phó thương hàn tuy không nổ ra thành dịch lớn, nhưng

với ñặc ñiểm dịch tễ hết sức phức tạp, ñã và ñang gây nên những thiệt hại

ñáng kể cho người chăn nuôi. Có thể nói rằng ở bất kỳ một cơ sở chăn nuôi

nào dù quy mô lớn hay nhỏ ñều xuất hiện bệnh này.

Khi ñời sống của nhân dân ngày càng ñược nâng cao, vấn ñề an toàn

thực phẩm trong ñó có lợn và thịt lợn sạch bệnh, không bị nhiễm Salmonella

là một yêu cầu cấp thiết. Có rất nhiều tác giả ñã công bố rằng sự nhiễm

Salmonella vào thân thịt lợn trong quá trình giết mổ chủ yếu liên quan ñến sự

nhiễm trùng Salmonella ở ruột (Borch và cs, 1996[38]; Berends và cs,

1997[35]). Do ñó, việc giảm tỷ lệ các trại bị nhiễm mầm bệnh Salmonella sẽ

làm sự an toàn thịt lợn tăng lên. Mục tiêu của các nhà khoa học, nhà sản xuất

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2

là xây dựng các ñàn gia súc sạch Salmonella.

Nhìn chung vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn ñã ñược

rất nhiều các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm. Ở Việt Nam ñã có một

số công trình nghiên cứu về Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn như:

Nguyễn Thị Nội và cs (1989)[20]; Lê Văn Tạo và cs (1993)[26]; Trần Xuân

Hạnh (1995)[11]; Cù Hữu Phú và cs (2000)[21]; ðỗ Trung Cứ (2004)[6]...

Theo Bryan (1988)[40]; Nielsen và Wegener (1997)[62]; Berends và cs

1998[36]; Schwartz (1999)[71]: Các ñàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây

thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại ñối

với con người. Bởi vậy mà mỗi biện pháp ngăn chặn có hiệu quả ở gia súc ñều cần

thiết và là ñiều kiện tiên quyết góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập cho

người chăn nuôi, chống ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khoẻ cộng ñồng.

Vì vậy mà việc phân lập vi khuẩn Salmonella, xác ñịnh serotyp và các ñặc

tính gây bệnh của chúng ở lợn, nhằm mục ñích phát hiện sớm và tìm ra hướng

phòng và trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết. Xuất phát từ thực

tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

"Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược

từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy và chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh".

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập, xác ñịnh hình thái, tính chất nuôi cấy, ñặc tính sinh vật hóa

học, serotyp và các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược

từ lợn sau cai sữa ở một số tỉnh phía Bắc.

- Chế tạo thử nghiệm vacxin ña giá có chứa một số các serotyp thường

gặp nhất từ những trường hợp nhiễm bệnh Salmonella ở lợn.