Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HÀ VĂN QUYẾT

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VIRUS

GÂY BỆNH MAREK Ở GÀ NUÔI CÔNG NGHIỆP

TẠI PHÍA BẮC VIỆT NAM VÀ GIẢI PHÁP

NÂNG CAO HIỆU LỰC VẮC XIN PHÒNG BỆNH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HÀ VĂN QUYẾT

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VIRUS

GÂY BỆNH MAREK Ở GÀ NUÔI CÔNG NGHIỆP

TẠI PHÍA BẮC VIỆT NAM VÀ GIẢI PHÁP

NÂNG CAO HIỆU LỰC VẮC XIN PHÒNG BỆNH

Ngành: Ký sinh trùng và Vi sinh vật học thú y

Mã số: 9.64.01.04

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên

2. PGS.TS. Phạm Công Hoạt

THÁI NGUYÊN - 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả trong luận án này là trung thực và nguyên gốc, không trùng lặp với những kết

quả đã được công bố.

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận án này đã được

cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận án

Hà Văn Quyết

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ của

các thầy, các cô, các bạn đồng nghiệp, cơ quan công tác và đặc biệt là gia đình.

Tôi xin trân trọng cảm ơn: Khoa Chăn nuôi - Thú y, trường Đại học Nông

lâm - Đại học Thái Nguyên; Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học mở Hà Nội đã

tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện

đề tài.

Hoàn thành luận án khoa học này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận

được sự giúp đỡ tận tình, đầy trách nhiệm và hết lòng vì khoa học của thầy giáo: GS.TS.

Nguyễn Quang Tuyên, PGS.TS. Phạm Công Hoạt, PGS.TS Nguyễn Viết Không và

PGS.TS. Phạm Thị Tâm.

Tôi xin trân thành cảm ơn: sự giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi về thời gian học

tập, nghiên cứu của Huyện ủy, Hội đồng nhân dân, Ủy ban nhân dân huyện Lập

Thạch, tỉnh Vĩnh Phúc; sự giúp đỡ nhiệt tình của Chi cục Thú y các tỉnh Vĩnh Phúc,

Phú Thọ, Bắc Giang, Hà Nội và khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học mở Hà Nội

đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thí nghiệm và thực hiện luận án này.

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: các thầy, các cô, các

bạn đồng nghiệp và đặc biệt là gia đình đã luôn giúp đỡ, động viên, hỗ trợ tôi trong

suốt thời gian qua.

Thái Nguyên, tháng 12 năm 2017

Tác giả luận án

Hà Văn Quyết

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii

MỤC LỤC................................................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...........................................................................vi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .............................................................................vii

DANH MỤC CÁC HÌNH..........................................................................................ix

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1

1. Tính cấp thiết của đề tài .....................................................................................1

2. Mục tiêu của đề tài .............................................................................................2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...........................................................2

3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ...............................................................................2

3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài................................................................................3

4. Những đóng góp mới của đề tài .........................................................................3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................4

1.1. Tình hình lưu hành bệnh Marek ở trong nước và trên thế giới........................4

1.1.1. Tình hình lưu hành bệnh Marek ở Việt Nam...................................................4

1.1.2. Tình hình lưu hành bệnh Marek trên thế giới ..................................................5

1.2. Cơ sở khoa học của đề tài ................................................................................6

1.2.1. Đặc tính sinh học cơ bản của virus gây bệnh Marek .......................................6

1.2.2. Triệu chứng lâm sàng bệnh Marek ................................................................14

1.2.3. Bệnh tích của bệnh Marek .............................................................................15

1.2.4. Chẩn đoán bệnh Marek ..................................................................................18

1.2.5. Dịch tễ học bệnh Marek.................................................................................19

1.2.6. Miễn dịch chống lại MDV .............................................................................22

1.2.7. Vắc xin với việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh Marek................................26

1.2.8. Các giải pháp phòng và trị bệnh Marek .........................................................27

Chương 2. NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................................30

2.1. Nội dung nghiên cứu......................................................................................30

2.1.1. Phân lập virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại một số tỉnh

phía Bắc Việt Nam.........................................................................................30

iv

2.1.2. Nghiên cứu xác định độc lực và gây bệnh thực nghiệm virus Marek

phân lập được trên các giống và lứa tuổi gà ..................................................30

2.1.3. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý đặc trưng do virus Marek phân lập được

đối với gà thí nghiệm .....................................................................................30

2.1.4. Nghiên cứu thử nghiệm phối hợp chất bổ trợ với vắc xin để tăng cường

hiệu quả miễn dịch của vắc xin phòng bệnh Marek.......................................30

2.2. Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu................................................................30

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................30

2.2.2. Nguyên liệu ....................................................................................................30

2.2.3. Hóa chất, sinh phẩm và môi trường nuôi cấy ................................................31

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................33

2.3.1. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................33

2.3.2. Thời gian nghiên cứu .....................................................................................33

2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................33

2.4.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu ..............................................................33

2.4.2. Phương pháp phân lập MDV và nhuộm Plaque ............................................33

2.4.3. Phương pháp hóa mô .....................................................................................35

2.4.4. Phương pháp xác định độc lực của virus trên phôi trứng gà .........................35

2.4.5. Phương pháp PCR và xác định trình tự gen Meq ..........................................36

2.4.6. Phương pháp Real-Time PCR định lượng số copy genome của virus MDV........37

2.4.7. Bố trí thí nghiệm xác định khả năng gây bệnh của MDV trên các giống

gà và lứa tuổi gà .............................................................................................38

2.4.8. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các chất tăng cường miễn

dịch đến hiệu quả của vắc xin HVT/Rispens.................................................39

2.5. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................40

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................41

3.1. Kết quả phân lập virus Marek........................................................................41

3.1.1. Kết quả mổ khám gà nghi mắc bệnh Marek ở một số địa phương. ...............41

3.1.2. Phân lập virus Marek .....................................................................................43

3.1.3. Đặc tính gene của virus Marek chủng MDV 6.13 .........................................44

3.2. Khả năng gây bệnh của chủng MDV phân lập được .....................................46

3.2.1. Khả năng gây bệnh của MDV 6.13 trên các giống gà thí nghiệm.................46

v

3.2.2. Khả năng gây bệnh của MDV phân lập được trên các giống gà thí

nghiệm ở các độ tuổi khác nhau.....................................................................51

3.2.3. Nghiên cứu sự bài thải của virus từ gà thí nghiệm gây nhiễm virus gây

bệnh MDV......................................................................................................58

3.3. Biểu hiện bệnh tích ở gà thí nghiệm do chủng MDV phân lập được gây nên.....60

3.3.1. Biểu hiện tổn thương đại thể ở các tổ chức của gà thí nghiệm......................60

3.3.2. Biểu hiện tổn thương vi thể ở các tổ chức của gà thí nghiệm........................66

3.3.3. Kết quả xác định khả năng gây bệnh trên phôi gà của MDV phân lập .........68

3.3.4. Kết quả xác định khả năng gây bệnh trên trên môi trường tế bào xơ

phôi vịt một lớp của MDV phân lập ..............................................................69

3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất tăng cường miễn dịch đến

hiệu quả bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek............................................70

3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch sự

hình thành đáp ứng miễn dịch của gà thí nghiệm với vắc xin phòng

bệnh Marek.....................................................................................................73

3.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch

đến sự hình thành khối u trong các tổ chức của gà thí nghiệm công

cường độc.......................................................................................................92

3.4.3. Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong các cơ quan có chức năng

miễn dịch của gà thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin

và các chất tăng cường miễn dịch ..................................................................93

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................................103

1. Kết luận ...............................................................................................................103

2. Kiến nghị.............................................................................................................104

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................105

PHỤ LỤC...............................................................................................................118

MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM .................................118

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1. ADC Antibody Dependent Cellmediated

2. ADN Acide Deoxyribo Nucleotic

3. APC Antigen Presenting Cell

4. CAM Chorioat Antoid Membran

5. CEF Chicken Embryo Fibroblast

6. CKC Chicken Kidney Cell

7. CMGF Chicken Myelomonocytic Growth Factor

8. CPE Cytopathogenic Effect

9. CPG-ODN Cytosine Phosphate Guanosine-Olygo Deoxy

Nucleotide

10. Poly I:C Chuỗi mạch ARN đôi Polyriboinosinic và

Polyribocytidylic

11. DEF Duck Embryo Fibroblast

12. DHBV Duck Hepatitis B Virus

13. ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

14. GDP Gross Domestic Product

15. HVT Herpesvirus of Turkey

16. IFN Interferon

17. IL Interleukin

18. MDV Marek Disease Virus

19. MHC Major Histocompatibility Complex

20. NKC Nature Killer Cell

21. PCR Polymerase Chain Reaction

22. PFU Plaque Forming Unit

23. RIF Resistance Inducing Factor

24. TLR Toll Like Receptor

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Tình hình dịch bệnh Marek tại các tỉnh phía Nam năm 2007 .................5

Bảng 3.1. Kết quả mổ khám gà nghi mắc bệnh Marek ở một số địa phương .......41

Bảng 3.2. Tương đồng gene Meq virus MDV 6.13 với MDV trên thế giới..........45

Bảng 3.3. Gene Meq MDV 6.13 và MDV cường độc trên thế giới và chủng

vắc xin ...................................................................................................46

Bảng 3.4. Mức độ gây bệnh của chủng MDV phân lập trên các giống gà thí nghiệm..... 47

Bảng 3.5. Triệu chứng lâm sàng bệnh Marek qua từng tháng theo dõi.................49

Bảng 3.6. Mức độ gây bệnh của chủng MDV phân lập được trên các giống

gà ở các độ tuổi......................................................................................54

Bảng 3.7. Số lượng bản copy của gen Meq bình quân trên 1 cá thể gà bài thải

trong 1 ngày (log10)..............................................................................59

Bảng 3.8. Biểu hiện bệnh tích do MDV gây cho gà thí nghiệm............................61

Bảng 3.9. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của gà

thí nghiệm..............................................................................................66

Bảng 3.10. Biểu hiện bệnh tích do MDV trên phôi gà 11 ngày tuổi .......................69

Bảng 3.11. Biểu hiện bệnh tích do MDV 6.13 trên trên môi trường tế bào xơ

phôi vịt...................................................................................................70

Bảng 3.12. Ảnh hưởng các yếu tố tăng cường miễn dịch đến hiệu quả bảo hộ

của vắc xin phòng bệnh Marek..............................................................71

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình

thành kháng thể bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek .......................75

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp  - IFN.....78

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp

các β - IFN.............................................................................................80

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp α-IFN....... 83

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp IL-4.......... 86

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp

IL-12p40 ................................................................................................87

viii

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp IL-10 ....90

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình

thành khối u ở gà sau công cường độc (Tỷ lệ % gà có khối u).............92

Bảng 3.21. Mức độ giảm số bản copy của gen Meq trong lách gà thí nghiệm

công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường

miễn dịch ...............................................................................................94

Bảng 3.22. Mức độ giảm các bản copy của gen Meq trong túi Fabricius của gà

thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất

tăng cường miễn dịch ............................................................................97

Bảng 3.23. Mức độ giảm số bản copy của gen Meq trong tuyến ức của gà thí

nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng

cường miễn dịch ..................................................................................100

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Bản đồ hệ gene của MDV .......................................................................8

Hình 3.1. Hình ảnh nuôi cấy phân lập MDV trên trên môi trường tế bào xơ

phôi vịt...................................................................................................43

Hình 3.2. Trình tự gene Meq virus chủng phân lập MDV 6.13 ............................44

Hình 3.3. Mức độ gây bệnh và gây chết của chủng MDV 6.13 ở gà thí

nghiệm ...................................................................................................50

Hình 3.4. Các biểu phiện tổn thương thần kinh của gà gây nhiễm với MDV 6.3.....51

Hình 3.5. Tỷ lệ gà mắc bệnh và chết do chủng virus MDV 6.13 trên các giống

gà thí nghiệm ở các độ tuổi ...................................................................52

Hình 3.6. Gà 6 tuần tuổi bại liệt sau khi gây nhiễm bằng chủng MDV 6.13 ........55

Hình 3.7. Tỷ lệ xuất hiện các biểu hiện tổn thương thần kinh do chủng virus

MDV 6.13 trên các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi .........................56

Hình 3.8. Mức độ bài thải virus MDV 6.13 của các giống gà thí nghiệm ở các

độ tuổi....................................................................................................58

Hình 3.9. Hình ảnh bệnh tích đại thể ở gà thí nghiệm do chủng MDV phân

lập được gây nên....................................................................................60

Hình 3.10. Tần suất xuất hiện bệnh tích trong các cơ quan của gà thí nghiệm.......62

Hình 3.11. Tỷ lệ gà thí nghiệm có tổn thương ở lách..............................................63

Hình 3.12. Tỷ lệ gà thí nghiệm có tổn thương ở thận .............................................63

Hình 3.13. Tỷ lệ gà thí nghiệm có tổn thương ở tim...............................................64

Hình 3.14. Tỷ lệ gà thí nghiệm có tổn thương ở dạ dày tuyến................................65

Hình 3.15. Tỷ lệ gà thí nghiệm có tổn thương ở dây thần kinh ngoại biên.............65

Hình 3.16. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của gà

thí nghiệm..............................................................................................67

Hình 3.17. Bệnh tích trên màng CAM phôi gà 14 ngày tuổi do MDV gây nên .....69

Hình 3.18. Hình ảnh gây hiệu ứng hủy hoại trên môi trường tế bào xơ phôi vịt

1 lớp do MDV MDV 6.13 qua các đời tiếp truyền sau 96 giờ..............70

Hình 3.19. Phản ứng trung hòa virus Marek với kháng thể thu được .....................73

Hình 3.20. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành

kháng thể bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek .................................76

Hình 3.21. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp  - IFN..79

x

Hình 3.22. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp

các β - I..................................................................................................81

Hình 3.23. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp α-IFN.... 84

Hình 3.24. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp IL-4....... 86

Hình 3.25. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp

IL - 12p40 ..............................................................................................88

Hình 3.26. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp

IL-10 ......................................................................................................91

Hình 3.27. Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong lách gà thí nghiệm công

cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch ....... 95

Hình 3.28. Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong túi Fabricius của gà thí

nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng

cường miễn dịch ....................................................................................98

Hình 3.29. Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong tuyến ức của gà thí

nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng

cường miễn dịch ..................................................................................101

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm qua, chăn nuôi gà ở nước ta có sự phát triển mạnh mẽ

theo hướng chăn nuôi công nghiệp tập trung, đóng góp lớn cho sự phát triển kinh

tế xã hội ở các địa phương. Theo báo cáo của Tổng cục Thống kê (2016) [12],

năm 2016 cả nước có khoảng 252 triệu con gà; với sản lượng trên 500 ngàn tấn

thịt, 8,5 tỷ quả trứng, cho thu nhập khoảng 63 ngàn tỷ đồng, chiếm 29,5% trong

tổng giá trị ngành nông nghiệp, chiếm 3,15% trong GDP. Tuy nhiên, chăn nuôi gà

còn gặp nhiều rủi ro về giá cả, thị trường, đặc biệt là các loại dịch bệnh luôn tiềm

ẩn, ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả sản xuất. Một trong những căn bệnh khá phổ

biến thường xuyên xảy ra trên đàn gà nuôi công nghiệp, đặc biệt là đàn gà đẻ, đó

là bệnh Marek, do Gallid herpesvirus gây ra, virus thường tồn tại trên biểu mô của

nang lông của gà nên có khả năng lây lan nhanh và mạnh qua đường hô hấp.

Bệnh Marek có hai biểu hiện chính là gây tăng sinh các tổ chức lypmpho và

suy giảm miễn dịch ở gà. Cho đến nay bệnh Marek vẫn chưa có thuốc điều trị đặc

hiệu, việc phòng bệnh phải dùng vắc xin tiêm cho gà. Trên thực tế những năm gần

đây một số trang trại chăn nuôi gà của nông dân, công ty CP, Japfa comfeed,.. ở

miền Bắc tình hình nhiễm bệnh Marek khá phức tạp gây thiệt hại lớn cho người

chăn nuôi. Qua thực tế cho thấy việc phòng bệnh cho đàn gà bằng vắc xin Marek

nhập ngoại được các công ty và hộ chăn nuôi thực hiện tương đối đầy đủ, tuy nhiên

đáp ứng miễn dịch của gà ở một số trang trại không cao, tỷ lệ bảo hộ của vắc xin

chưa đảm bảo. Ở nước ta, những năm gần đây, hầu hết các cơ sở sản xuất gà giống,

mặc dù đã dùng vắc xin song bệnh vẫn xuất hiện làm ảnh hưởng đến chất lượng con

giống (Phan Văn Lục, 2008) [7].

Hiện tượng gà vẫn bị bệnh sau khi tiêm vắc xin Marek có nhiều nguyên nhân

trong đó nguyên nhân kỹ thuật về sự phù hợp chủng là quan trọng. Các loại vắc xin

hiện đang sử dụng được tạo ra từ những chủng kinh điển, sử dụng lâu dài trên toàn

thế giới không hoàn toàn phù hợp với các biến chủng mới, độc lực cao xuất hiện

thường xuyên ở các vùng địa lý khác nhau [(Baigent SJ et al., 2006) [25]; (Schat

KA và Baranowski E, 2007) [100].