Nghiên cứu mối quan hệ loài của ốc cối (conus spp ) ở vùng biển nam trung bộ việt nam dựa trên chỉ

Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình

SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH

Lời cảm ơn

Trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài tại trường Đại học Nha Trang em

nhận được sự quan tâm của cơ quan, nhà trường, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô

giáo, bạn bè và người thân.

Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo của trường Đại học Nha Trang, thầy

cô giáo cán bộ Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã truyền đạt những kiến

thức và kinh nghiệm quý báu trong những năm học vừa qua.

Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới

PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa và TS. Đặng Thúy Bình đã tận tình quan tâm hướng

dẫn và chỉ bảo giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.

Em xin cảm ơn Ths. Trương Thị Thu Thủy, cán bộ tổ Nghiên cứu Triển khai

công nghệ, cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ phòng thí nghiệm: Bộ môn Công

Nghệ Sinh học, bộ môn Môi Trường thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi

Trường trường Đại học Nha Trang giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ động viên của gia đình, bạn

bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ em trong suốt quá trình

thực hiện luận văn.

Vì kiến thức và thời gian có hạn nên luận văn tốt nghiệp của em không sao

tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong được sự góp ý của các thầy cô giáo để luận

văn của em hoàn thiện hơn và đạt kết quả cao nhất. Em xin chân thành cảm ơn!

Cuối cùng, em xin kính chúc mọi người dồi dào sức khỏe và thành công!

Nha Trang ngày 07 tháng 07 năm 2011

Sinh viên

Lê Thị Bích Hảo

Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình

SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1. TỔNG QUAN VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU...............................................................4

I.1.1. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Cù Lao Chàm ..........4

I.1.2. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường huyện đảo Lý Sơn ..........5

I.1.3. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường thị xã Sông Cầu ..............5

I.1.4. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường vịnh Vân Phong..............7

I.2. TỔNG QUAN VỀ ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ ỐC CỐI (CONUS SPP.) .......................9

I.2.1. Tổng quan ốc cối.................................................................................................9

I.2.1.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố .....................................................................9

I.2.1.2. Đặc điểm hình thái bên ngoài và cấu tạo bên trong của ốc cối..................13

I.2.1.3. Đặc điểm sinh học và sinh sản ...................................................................17

I.2.2. Tổng quan độc tố ốc cối....................................................................................18

I.2.2.1. Giới thiệu về độc tố ốc cối .........................................................................18

I.2.2.2. Cấu tạo bộ máy sinh độc tố ........................................................................19

I.2.2.3. Phân loại độc tố conotoxin .........................................................................22

I.2.2.4. Ứng dụng y học của độc tố ốc cối..............................................................24

I.3. TỔNG QUAN VỀ TY THỂ VÀ DNA TY THỂ.....................................................26

I.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS SPP.) ..........................32

I.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới....................................................................32

I.4.1.1. Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loài của ốc cối .......32

I.4.1.2. Nghiên cứu di truyền độc tố .......................................................................35

I.4.1.3. Nghiên cứu di truyền quần thể ốc cối.........................................................36

I.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước......................................................................36

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU..................................39

Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình

SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH

II.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................................40

II.2.1. Phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái ốc cối.............................42

II.2.2. Tách chiết DNA các loài ốc cối.......................................................................44

II.2.3. Phản ứng khuếch đại........................................................................................46

II.2.4. Giải và phân tích trình tự .................................................................................48

II.2.5. Xử lý số liệu xây dựng cây phát sinh loài........................................................48

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

III.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI ỐC CỐI .......................................................................53

III.2. NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN ỐC CỐI.................................................................59

III.2.1. Kiểm tra DNA tổng số....................................................................................59

III.2.2. Khuếch đại gen...............................................................................................59

_Toc298320803III.2.3. Đa dạng di truyền DNA ốc cối...............................................60

III.2.4. Xây dựng cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mt DNA...............................61

III.3. THẢO LUẬN........................................................................................................67

III.3.1. Mối quan hệ loài ốc cối dựa trên chỉ thị phân tử CO1 mtDNA .....................67

III.3.2. Mối quan hệ giữa loài và chế độ dinh dưỡng.................................................69

III.3.3. Sự khác biệt di truyền giữa các trình tự .........................................................71

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT

IV.1. KẾT LUẬN...........................................................................................................73

IV.2. Ý KIẾN ĐỀ XUẤT...............................................................................................74

TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................75

Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình

SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Đặc điểm phân bố, sinh thái và kích cỡ trung bình của một số loài ốc phổ

biến ở biển Việt Nam .....................................................................................................11

Bảng 1.2: Các superfamily của conotoxin (Bingham, 2010).........................................24

Bảng 1.3: Các peptide độc tố với những liệu pháp tiềm năng .......................................26

Bảng 1.4: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA.....30

Bảng 2.1: Thông số dùng để phân loại kích cỡ chiều dài của ốc theo Verlag Christa

Hemmen (1995) .............................................................................................................43

Bảng 2.2: Công thức được dùng để phân loại trọng lượng của các loài ốc theo

Verlag Christa Hemmen (1995).....................................................................................43

Bảng 2.3: Công thức dùng để phân loại hình thái của ốc cối theo Verlag Christa

Hemmen (1995) .............................................................................................................43

Bảng 2.4: Công thức dùng để phân loại kích cỡ của ốc cối theo Verlag Christa

Hemmen (1995) .............................................................................................................44

Bảng 2.5: Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa ........49

Bảng 2.6: Trình tự gen CO1 mtDNA và chế độ ăn của các loài ốc cối........................50

Bảng 3.1: Kích thước, khối lượng, đường kính của một số loài ốc cối .........................57

Bảng 3.2: Bảng giá trị tính theo công thức chuẩn quốc tế của một số loài ốc cối.........58

Bảng 3.3:Kết quả sự khác biệt di truyền giữa các trình tự.............................................60

Bảng 3.4: Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại từ các phương pháp MP, ML và BI. ........64

Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình

SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Bản đồ phân bố ốc cối Conus trên thế giới....................................................10

Hình 1.2: Các thông số hình thái vỏ của ốc cối (Conus spp.)........................................13

Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.) ............................14

Hình 1.4: Cấu tạo bên trong của ốc cối..........................................................................14

Hình 1.5: Phương thức săn mồi theo dạng móc câu của ốc cối .....................................16

Hình 1.6: Phương thức bắt mồi dạng lưới của ốc cối ....................................................16

Hình 1.7: Vòng đời của ốc cối (Conus spp.) (Rockel và cs, 1995)................................18

Hình 1.8: Cấu tạo tuyến nọc độc của ốc cối. (Olivera, 2002, có bổ sung) ....................20

Hình 1.9: Răng kitin Conus spp. ....................................................................................21

Hình 1.10: Cấu trúc của ty thể .......................................................................................26

Hình 1.11: DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã

hóa protein......................................................................................................................28

Hình 1.12: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile......................................................31

Hình 2.1: Địa điểm thu mẫu (Cù Lao Chàm, Lý Sơn, Sông Cầu, Vân Phong). ............40

Hình 2.2: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu .....................................................................41

Hình 2.3: Cấu tạo bên ngoài của ốc cối .........................................................................42

Hình 2.4: Chương trình nhiệt độ của phản ứng khuếch đại ...........................................47

Hình 2.5: Chương trình nhiệt độ của phản ứng tiền giải trình tự...................................48

Hình 3.1: Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở vùng biển Việt Nam ..................53

Hình 3.2: Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu ốc cối .........................................59

Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CO1 mtDNA của các mẫu ốc cối.60

Hình 3.4: Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối thu tại vùng biển

Nam Trung Bộ, Việt Nam..............................................................................................62

Hình 3.5: Cây phát sinh loài theo phương pháp Baysian Inference (BI) dựa trên gen

CO1 mtDNA của ốc cối thu tại vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam..........................63

Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình

SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CO1 Cytochrome c oxydase subuint 1

DNA Deoxyribonucleic acid

RNA Ribonucleic acid

mtDNA (mitochondrial DNA) DNA ty thể

16S rDNA 16S ribosomal DNA

PCR Polymerase Chain Reaction

L (Shell Length) Chiều dài của ốc (mm)

PMD (Position of Maximum Diameter of

last whorl)

Vị trí của đường kính lớn nhất tương đối

của ốc cối ở cuối vòng xoắn.

RD (Relative Diameter of last whorl) Đường kính lớn nhất tương đối của ốc

cối

RSH (Relative Spire Height, as

proportion of shell length)

Chiều cao tương đối của tháp vỏ

RW (Relative Weight of shell) Trọng lượng tương đối của ốc cối

Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình

1

SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH

MỞ ĐẦU

Thực tế hiện nay cho thấy đa dạng sinh học đang bị suy thoái với tốc độ rất

nhanh. Bằng các hoạt động của mình, con người đã gây mất hàng loạt các khu rừng

nguyên sinh, các vùng đất ngập nước qua đó đã làm gia tăng tốc độ tuyệt chủng của

các loài gấp 1.000 lần so với tỷ lệ tự nhiên. Số loài và số lượng cá thể của các loài

hoang dã bị suy giảm mạnh. Các nguồn gen hoang dã cũng đang trên đà suy thoái

nhanh và thất thoát.

Bờ biển Việt Nam dài 3260 km và có hơn 3000 đảo lớn nhỏ. Việt Nam có

tiềm năng về kinh tế biển với khoảng 20 hệ sinh thái biển, trong đó có hơn khoảng

11000 loài bao gồm 2500 loài cá biển, 225 loài tôm, hơn 200 loài thủy sinh vật, gần

700 loài động vật nổi và 100 loài thực vật rừng ngập mặn, 15 loài cỏ biển và hơn

6000 loài động vật không xương sống. Theo ước tính có khoảng 1122 km2

rạn san

hô phân bố từ Bắc vào Nam, 90% các loài san hô cứng ở vùng biển Ấn Độ- Thái

Bình Dương được tìm thấy ở Việt Nam (http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/tai-nguyen￾he-sinh-thai-bien-viet-nam.514937.html).

Ở nước ta, ốc là một trong những nhóm nguồn lợi hải sản quan trọng, có mức

độ phong phú về thành phần loài, trong đó có nhiều loài có giá trị thương mại cao

như ốc Tù Và, ốc Hương, ốc Bàn Tay, ốc Cối. Trong số đó có thể kể đến ốc Cối, là

một trong những họ động vật thân mềm lớn thuộc loài ăn thịt và có nọc độc. Các

loài ốc Cối có giá trị kinh tế cao do vỏ của chúng có màu sắc và hoa văn đẹp nên

thường được khai thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩm lưu niệm.

Ngoài ra, ốc Cối còn là nguồn nguyên liệu sản xuất "thần dược" chữa các cơn đau

mãn tính, ung thư và nhiều bệnh khác. Vì những lợi ích về kinh tế và y học đó mà

tình trạng khai thác bừa bãi các loài ốc Cối ngày càng gia tăng. Bởi vậy, đòi hỏi

chúng ta phải có các nghiên cứu để bảo tồn một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài

nguyên này.

Các nghiên cứu về ốc Cối ở nước ta cho tới nay mới chỉ được thực hiện ở

mức độ khảo sát, thu thập mẫu và tư liệu liên quan; xác định độc tính và kiểm

chứng tính chất của một số độc tố (http://www.vnio.org.vn/ ). Hiện nay các nghiên

Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa & TS. Đặng Thúy Bình

2

SVTH: Lê Thị Bích Hảo – Lớp 49SH

cứu phát sinh chủng loại nào về ốc Cối Việt Nam tiến hành ở mức độ phân tử còn

nhiều hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu và xây dựng phát sinh chủng loại các loài ốc cối

Việt Nam bằng các phương pháp sinh học phân tử là rất cần thiết, nó sẽ góp phần

vào công tác bảo tồn và lưu giữ nguồn gen ốc Cối Việt Nam.

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ

loài của ốc cối (Conus spp.) ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên chỉ

thị phân tử gen CO1 của DNA ty thể (CO1 mtDNA)”. Dựa trên việc nghiên cứu

mối quan hệ giữa các loài này ta tiến hành điều tra để đánh giá hiện trạng nguồn lợi

ốc cối ở vùng biển Việt Nam. Đây là vấn đề rất cần thiết vì bước đầu tạo cơ sở dữ

liệu đầu vào cần thiết cho việc tính toán, đề xuất các biện pháp quản lý và sử dụng

hợp lý nguồn lợi ốc cối ở vùng biển Việt Nam.

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:

Khảo sát và đánh giá đặc điểm di truyền của loài ốc cối (Conus spp.).

Bước đầu khảo sát mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc Conus thu được

vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên phân tích giải trình tự gen

CO1 của DNA ti thể (Mitochondrial DNA).

NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu mối quan hệ loài của các loài ốc cối (Conus spp.) ở vùng biển

Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử gen CO1 của DNA ty

thể (CO1 mtDNA).

Xây dựng cây phát sinh loài của các loài ốc cối ở vùng biển Nam Trung

Bộ Việt Nam.