Nghiên cứu cố định enzyme lipase trên nano từ tính ứng dụng trong phản ứng chuyển hoá lipit

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

VÕ THỊ THÙY TRANG

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME LIPASE

TRÊN NANO TỪ TÍNH ỨNG DỤNG TRONG

PHẢN ỨNG CHUYỂN HÓA LIPIT

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Đà Nẵng - Năm 2015

Công trình được hoàn thành tại

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Bá Trung

Phản biện 1: TS. Nguyễn Thị Bích Tuyết

Phản biện 2: TS. Bùi Xuân Vững

Luận văn đã được bảo vệ tại Hội đồng chấm Luận văn tốt

nghiệp Thạc sĩ khoa học tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 28

tháng 07 năm 2015

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin-Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với công nghệ nano, công

nghệ sinh học là ngành khoa học đang được quan tâm phát triển. Một

trong các hướng nghiên cứu liên quan đến công nghệ sinh học là

công nghệ enzyme. Các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng

nhiều, đáp ứng cho nhu cầu sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế …

Enzyme đã dần từng bước làm thay đổi và nâng cao hiệu quả

của một số quá trình công nghệ, đáp ứng nhu cầu phát triển hiện nay.

Trong số các enzyme được sử dụng phổ biến, lipase là một trong

những họ enzyme quan trọng, đã và đang được sử dụng rộng rãi để

làm xúc tác các phản ứng khác nhau như: phản ứng thuỷ phân chất

béo, phản ứng ester chéo hoá, phản ứng alcoholysis, … Tuy nhiên,

lipase tự do dễ bị bất hoạt trong quá trình phản ứng và khó tách loại

ra khỏi sản phẩm phản ứng cũng như tái sử dụng. Khắc phục các

nhược điểm này, lipase thường được cố định trên chất mang để có thể

tái sử dụng và cải thiện khả năng hoạt động ổn định trong các điều

kiện phản ứng khác nhau [6], [26], [30].

Bên cạnh đó, Khoa học và Công nghệ nano ngày càng phát

triển mạnh.Việc nghiên cứu nano kim loại hiện đang được triển khai

ứng dụng sâu rộng cho nhiều ứng dụng khác nhau. Trong số đó,

nghiên cứu về hạt nano từ (Magnetic nano particles - MNPs) đã thu

hút nhiều sự chú ý nhờ vào những tính năng nổi bật của nó như độ

tương thích sinh học cao, tính siêu thuận từ, diện tích bề mặt riêng

lớn và không độc tính. Chính vì vậy, hạt nano từ được ứng dụng

trong chụp ảnh cộng hưởng từ (MRI), cảm biến sinh học

2

(biosensing), chất mang thuốc có định hướng, tách loại các phân tử

sinh học... Ngoài ra, do các hạt nano từ tính có diện tích bề mặt riêng

lớn, từ dư và lực kháng từ bằng 0, độ tương thích sinh học cao nên là

chất mang enzyme tốt, dễ dàng thu hồi enzyme gắn trên nano từ dưới

tác động của từ trường ngoài [10], [11].

Việc cố định enzyme trên hạt nano oxit sắt từ tính cho phép dễ

dàng thu hồi cũng như mở rộng điều kiện hoạt động so với enzyme tự

do, ứng dụng xúc tác cho phản ứng ester chéo hoá dầu thực vật để

sản xuất biodiesel – nhiên liệu sinh học – năng lượng tái tạo hiệu quả

để thay thế cho các nguồn năng lượng hoá thạch đang có nguy cơ bị

cạn kiệt trong vài thập niên tới.

Chính vì lẽ đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu cố định

enzyme lipase trên nano từ tính ứng dụng trong phản ứng chuyển

hoá lipid”.

2. Mục đích nghiên cứu

- Tổng hợp được MNPs có kích thước tương đối đồng nhất, độ

ổn định cao, từ tính lớn để làm chất mang enzyme.

- Xây dựng phương pháp biến tính bề mặt MNPs, cố định

enzyme phù hợp để tổng hợp được enzyme nano từ tính có hoạt tính

xúc tác cao, bền trong môi trường phản ứng, ổn định và có khả năng

tái sử dụng nhiều lần.

- Ứng dụng phương pháp điều chế xúc tác enzyme từ tính để

tổng hợp xúc tác enzyme nano từ tính cho một số phản ứng liên quan

đến tổng hợp hóa dược, biodiesel.

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

3.1. Đối tƣợng nghiên cứu

3.2. Phạm vi nghiên cứu

4. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu

3

4.1. Cách tiếp cận

4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

4.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết

4.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm

4.3. Nội dung nghiên cứu

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

6. Bố cục luận văn

4

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ NANO

1.1.1. Giới thiệu về công nghệ nano

1.1.2. Cơ sở khoa học của công nghệ nano

1.1.3. Các phƣơng pháp điều chế vật liệu nano

1.2. TỔNG QUAN VỀ NANO TỪ TÍNH

1.2.1. Giới thiệu về hạt nano từ tính

1.2.2.Cấu trúc hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4 NPs)

1.2.3. Những tính chất đặc biệt của MNPs

1.2.4. Các phƣơng pháp điều chế MNPs

1.3. ĐỘ BỀN VÀ ĐẶC TRƢNG CỦA MNPS

1.3.1.Bảo vệ bằng cách bao bọc bằng lớp phủ là hợp chất

hữu cơ

1.3.2.Bảo vệ bằng cách bao bọc bằng lớp phủ là hợp chất

vô cơ

1.4. SỰ BIẾN ĐỔI VÀ ỔN ĐỊNH CỦA MAGNETITEFE3O4

1.5. ỨNG DỤNG SINH HỌC CỦA MNPS

1.5.1.Ứng dụng trong y sinh

1.5.2. Ứng dụng trong xử lý môi trƣờng

1.5.3.Chất mang xúc tác

1.6. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME

1.6.1. Khái quát về enzyme

1.6.2. Cơ chế xúc tác của enzyme

1.7. ENZYME LIPASE

1.7.1. Giới thiệu về enzyme lipase

1.7.2. Nguồn thu nhận enzyme lipase

5

1.7.3. Đặc điểm của lipase

1.7.4. Tính đặc hiệu

1.7.5. Khả năng chịu nhiệt

1.7.6. Khả năng chịu lực cắt

1.7.7. Trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác

1.7.8. Ứng dụng của lipase

1.8. ENZYME CỐ ĐỊNH

1.8.1. Sơ lƣợc về enzyme cố định

1.8.2. Kĩ thuật cố định enzyme trên chất mang nano

1.9. PHẢN ỨNG THỦY PHÂN CỦA LIPID

1.9.1. Lipid

1.9.2. Xúc tác enzyme cho phản ứng thủy phân

1.10. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC

CỦA ĐỀ TÀI

1.10.1. Ngoài nƣớc

1.10.2. Trong nƣớc

6

CHƢƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ

2.1.1. Hóa chất

2.1.2. Dụng cụ thiết ị

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Tổng hợp hạt nano sắt từ (Fe3O4 NPs) bằng phƣơng

pháp đồng kết tủa

Khuấy Nƣớc cất

Dung dịch amoniac

NH4OH

Khuấy

1. Khuấy và gia nhiệt

2. Thu hồi sản phẩm

3. Rửa bằng nước cất đến

pH trung tính

Dung dịch màu đỏ

nâu

FeCl2.4H2O FeCl3.6H2O

Dung dịch màu

Nano oxit sắt từ

(Fe3O4NPs)

7

2.2.2. Biến tính bề mặt Fe3O4 NPs bằng cách phủ chitosan

Khuấy

Khuấy

Dung dịch

Glutaradehyde 0,1%

1. Thu hồi sản phẩm

2. Rửa bằng nước cất loại

bỏ chitosan

Nano oxit sắt từ phủ chitosan

(Fe3O4NPs - Chitosan)

Nano oxit sắt từ

(Fe3O4NPs)

Dung dịch Chitosan

1%

Hỗn hợp dung

dịch

Hỗn hợp dung dịch

8

2.2.3. Cố định enzyme lipase lên hạt nano sắt từ

(Fe3O4NPs)–CS

Khuấy

Dung dịch

Glutaradehyde 10%

Hỗn hợp dung dịch

Thu hồi sản phẩm bằng từ

trường và Rửa bằng nước

cất loại bỏ Glutaraldehyde

Chất mang được hoạt hóa

bề mặt

Dung dịch Lipase

(1011UI/g)

1. Khuấy.

2. Thu hồi sản phẩm.

3. Rửa bằng đệm photphat

để loại bỏ enzyme lipase tự

do

Lipase cố định

(Fe3O4NPs – Chitosan - Lipase)

Dung dịch đệm

photphat

pH ≈ 7 5

Fe3O4NPs - Chitosan

9

2.2.4. Phản ứng thủy phân lipid với xúc tác enzyme cố định

Chuẩn bị các mẫu thực hiện phản ứng thủy phân theo tỉ lệ về

thể tích 1 : 5 giữa dầu và nước, lần lượt như sau:

- Mẫu 1 (mẫu đối chứng)

- Mẫu 2 (mẫu đối chứng, thực hiện với enzyme lipase tự do)

- Mẫu 3 (mẫu kiểm chứng, thực hiện với xúc tác của enzyme

nano từ tính Fe3O4NPs – CS – lipase)

2.3.5. Phân tích đặc trƣng vật liệu

 Phân tích xác định kích thước và hình thái bề mặt bằng

kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

 Phân tích xác định hình thái bề mặt của sản phẩm bằng

phương pháp đo SEM

 Phân tích cấu trúc tinh thể của sản phẩm bằng phương

pháp đo nhiễu xạ tia X

 Phân tích từ tính của sản phẩm bằng phương pháp đo

đường cong từ trễ

 Đánh giá hiệu quả biến tính bề mặt của Fe3O4NPs bằng

các tác nhân hữu cơ

2.3.6. Phân tích sản phẩm phản ứng thủy phân bằng

phƣơng pháp sắc kí GC-MS

10

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TỔNG HỢPFE3O4NPS BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỒNG

KẾT TỦA VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TRƢNG CỦA NÓ

3.1.1. Tổng hợp Fe3O4NPs

Chúng tôi tiến hành điều chế nano oxit sắt từ Fe3O4NPs bằng

phương pháp đồng kết tủa từ hỗn hợp dung dịch Fe2+ và Fe3+ với chất

tạo kết tủa keo là dung dịch amoniac (NH4OH). Đây là phương pháp

tổng hợp Fe3O4NPs từ môi trường đồng thể theo quy trình được trình

bày ở tiểu mục 2.3.1.

Phản ứng để hình thành các hạt nano Fe3O4NPs như sau:

Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH-

→ Fe3O4 + 4H2O

Màu sắc của sản phẩm và sự tách loại dưới tác dụng của từ

trường ngoài được trình bày ở hình 3.1.

Hình 3.1. Màu sắc của sản phẩm Fe3O4NPs được điều chế bằng pháp

đồng kết tủa từ hỗn hợp dung dịch Fe2+ và Fe3+

với chất tạo kết tủa

keo là dung dịch amoniac theo tỉ lệ mol Fe3+ : Fe2+ = 2 : 1. (a).

Trước khi áp từ trường ngoài; (b). Saukhi áp từ trường ngoài