Nghiên cứu cố định enzyme glucose oxidase lên nano fe3o4np-cs và đánh giá hoạt tính của nó

1

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HOÀNG NHƯ NGỌC

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYM GLUCOSE

OXIDASE LÊN NANO Fe3O4NP-CS VÀ ĐÁNH

GIÁ HOẠT TÍNH CỦA NÓ

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

Mã số: 60 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÓA HỌC

-------------

ĐÀ NẴNG, NĂM 2017

2

Công trình được hoàn thành tại

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Nguyễn Bá Trung

Phản biện 1:

TS. Nguyễn Đình Anh

Phản biện 2:

PGS. TS. Lê Tự Hải

Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn

tốt nghiệp thạc sĩ Hóa hữu cơ họp tại Trường Đại học Sư

phạm - ĐHĐN vào ngày 09 tháng 09 năm 2017.

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

3

MỞ ĐẦU

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ nano, hạt nano

từ tính đang được nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt là nano oxit sắt từ

(Fe3O4NP). Do tính chất siêu thuận từ, kích thước có thể điều khiển ở

quy mô nano met, độ độc tính thấp, Fe3O4NP đang được các nhà

khoa học tập trung nghiên cứu và khai thác trong nhiều ứng dụng

khác nhau thuộc các lĩnh vực vật lý, y học, sinh học … [1],[5]. Tuy

nhiên, hạt Fe3O4NP có xu hướng không bền tập hợp do sự tương tác

từ trường lưỡng cực giữa các hạt. Để khắc phục nhược điểm này,

biến tính và chức năng hóa bề mặt Fe3O4NP bằng các polymer sinh

học đã và đang được thực nghiệm rộng rãi, bởi phương pháp này có

thể tạo ra những nhóm chức mới cho vật liệu Fe3O4NP cho các ứng

dụng khác nhau [14].

Chitosan, poly(1→4)-2-amino-2-deoxy-d-glucan, là một

polyaminosaccharide với nhiều tính chất sinh học và hóa học quý. Vì

vậy, chitosan và các dẫn xuất của nó đã được sử dụng rộng rãi trong

các lĩnh vực y học, dược phẩm và công nghệ sinh học [16]. Những

năm trở lại đây, các công trình nghiên cứu liên quan đến điều chế

nano từ tính-chitosan thu được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học

[16-18].

Trong công trình này, chúng tôi nghiên cứu quy trình tổng

hợp vật liệu xúc tác enzyme nano từ tính trên cơ sở Fe3O4NP￾Chitosan-Glucose oxidase (Fe3O4NP-CS- GOx) và đánh giá hoạt tính

của hệ enzyme thu được, trên cơ sở đó xây dựng phương pháp cố

định enzyme nói riêng và các phân tử sinh học nói chung lên vật liệu

Fe3O4NP, ứng dụng cho các mục đích khác nhau trong y sinh.

4

Với những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu cố

định enzyme glucose oxidase lên nano Fe3O4NP - CS và đánh giá

hoạt tính của nó”.

2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Xây dựng phương pháp tối ưu cố định enzyme lên hạt nano

oxit sắt từ tính, từ đó ứng dụng kĩ thuật đã xây dựng để cố định

enzyme lên vật liệu Fe3O4NP.

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng nghiên cứu

Phương pháp cố định enzyme glucose oxidase lên bề mặt vật

liệu Fe3O4NP.

3.2. Phạm vi nghiên cứu

- Quy trình gắn kết enzyme GOx lên bề mặt Fe3O4NP được

biến tính bằng Chitosan.

- Đánh giá hoạt tính xúc tác của Fe3O4NP-CS-GOx cho phản

ứng oxy hóa glucose.

4. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4.1. Phương pháp nghiên cứu

! Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Thu thập, nghiên cứu các tài liệu có liên quan đến lĩnh vực

của đề tài: tổng hợp hạt vật liệu Fe3O4NP; tính chất từ của vật liệu

Fe3O4NP; biến tính bề mặt vật liệu Fe3O4NP bằng các polymer sinh

học; các kĩ thuật cố định enzyme lên chất mang …

! Phương pháp hóa học

Sử dụng phương pháp đồng kết tủa kết hợp với thủy nhiệt để

điều chế Fe3O4NP từ hỗn hợp muối Fe2+ và Fe3+.

! Phương pháp phân tích vật lý

5

Phân tích các đặc trưng của vật liệu đã tổng hợp: Chụp ảnh

hiển vi điện tử truyền qua (TEM), Nhiễu xạ tia X (XRD), Phổ tán sắc

năng lượng tia X (EDX), Đo đường cong từ trễ, Phân tích nhiệt, Phổ

hồng ngoại IR

4.2. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu tổng hợp vật liệu Fe3O4NP bằng phương pháp

đồng kết tủa hỗn hợp muối FeCl2.4H2O và FeCl3.6H2O với dung dịch

ammoniac kết hợp với thủy nhiệt trong môi trường trơ.

- Biến tính bề mặt vật liệu Fe3O4NP bằng chitosan.

- Cố định enzyme glucose oxidase lên trên bề mặt Fe3O4NP–

CS và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme

glucose oxidase.

- Đánh giá hoạt tính của hệ xúc tác Fe3O4NP–CS–GOx.

5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Cung cấp thông tin khoa học về phương pháp cố định

enzyme lên vật liệu nano từ tính Fe3O4NP, từ đó mở rộng ứng dụng

của vật liệu Fe3O4NP trong các nghiên cứu liên quan đến y sinh.

6. BỐ CỤC LUẬN VĂN

6

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. HẠT NANO OXIT SẮT TỪ

1.1.1. Giới thiệu về oxit sắt từ

Oxit sắt từ Fe3O4 (Magnetite) được viết dưới dạng:

Fe2+(Fe3+O2)2 hoặc FeO.Fe2O3; trong đó, tỉ lệ Fe2+ và Fe3+ là 1:2. Hạt

oxit sắt từ Fe3O4 có cấu trúc tinh thể ferit lập phương cấu trúc spinel

đảo.

Oxit sắt từ có số phân tử trong một ô cơ sở Z=8, gồm 56

nguyên tử trong đó 8 ion Fe2+ và 32 ion O2-

. Bán kính của nguyên tử

oxi lớn (cỡ 1,32A0

) do đó nguyên tử O2- trong mạng hầu như nằm sát

nhau tạo thành một mạng lập phương tâm mặt. Cấu trúc spinel có thể

xem như được tạo ra từ mặt phẳng xếp chặt của các ion O2- với các lỗ

trống tứ diện và bát diện được lắp đầy bằng các ion kim loại[6][22].

Hình1.1. Vị trí tứ diện và bát diện trong mạng tinh thể Fe3O4

1.1.2. Tính chất đặc trưng của oxit sắt từ

1.1.3. Tính siêu thuận từ hạt nano oxit sắt từ

Đặc điểm quan trọng của vật liệu siêu thuận từ là có từ độ

lớn khi có từ trường bên ngoài và mất hết từ tính khi từ trường ngoài

bằng không. Vì khi có sự tác động của từ trường ngoài thì các

mômen từ nhanh chóng sắp xếp theo chiều của từ trường và tồn tại

một độ từ hóa riêng. Khi từ trường ngoài ngừng tác động, các

7

mômen từ của hạt lại sắp xếp và định hướng ngẫu nhiên như lúc đầu,

vật liệu sẽ không còn từ tính nữa. Khi đó độ từ hóa và lực kháng từ

bằng 0.

1.1.4. Các phương pháp điều chế hạt nano sắt từ

1.1.5. Ứng dụng của hạt nano sắt từ

1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN

1.2.1. Nguồn gốc và giới thiệu sơ lược chitin

Chitin có tên khoa học: poly[-β(1-4)-2-acetamido-2-deoxy￾D-glycopyranose].

Công thức phân tử đơn giản: (C8H13O5N)n

Hình 1.6. Cấu trúc hoá học của chitin

1.2.2. Cấu trúc và tính chất của chitosan

Chitosan có tên khoa học: poly[-β(1-4)-2-amido-2-deoxy-D￾glycopyranose].

Công thức phân tử đơn giản: (C6H11NO4)n

Hình 1.7. Cấu trúc của chitosan

8

1.2.3. Ứng dụng của chitosan

1.3. ENZYME CỐ ĐỊNH

1.3.1. Một số khái niệm

Enzyme cố định là enzyme bị giam giữ, hoặc được cố định

trong một vùng, một khoang nhất định, không bị hòa tan trong điều

kiện bình thường, vẫn giữ được hoạt tính xúc tác, có thể sử dụng liên

tục và lặp lại nhiều lần [5]. Các chất dùng để gắn hoặc giữ enzyme

thường được gọi là chất mang hay giá thể.

1.3.2. Các phương pháp cố định enzyme

1.3.3. Đặc điểm của enzyme cố định

- Enzyme cố định có hoạt độ riêng thấp hơn hoạt độ riêng

của enzyme hòa tan.

- Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis –

Menten. Tuy nhiên, trong phản ứng giữa cơ chất với enzyme cố định

có những sai khác nhất định.

- Enzyme cố định có tính bền nhiệt hơn enzyme hòa tan cùng

loại vì chúng được bảo vệ trong chất mang.

- Enzyme cố định có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang

kiềm hoặc acid so với pH tối ưu của enzyme hòa tan cùng loại.

- Enzyme cố định có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme hòa

tan cùng loại.

- Có thể tái sử dụng enzyme cố định nhiều lần.

1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định

Enzyme có thể thay đổi về pH, nhiệt độ hoạt động, cũng như

các giá trị của hằng số Michaelis – Menten và tính chất đặc hiệu [8].

Tuy nhiên, những thay đổi này còn phụ thuộc nhiều vào bản chất hóa

học của chất mang. Nói chung, enzyme cố định thường bền với các

tác nhân biến tính hơn, nhưng hoạt tính riêng thường thấp hơn

9

enzyme hòa tan.

1.4. TỔNG QUAN VỀ ENZYME GLUCOSE OXIDASE

1.4.1. Giới thiệu về enzyme glucose oxidase

Glucose oxidase (GOx) là enzyme xúc tác cho quá trình oxi

hóa β-D–glucose thành acid gluconic bằng cách sử dụng oxy làm

chất nhận điện tử, đồng thời sinh ra hydropeoxit (H2O2) và không

hoạt động trên α-D-glucose.

1.4.2. Nguyên tắc hoạt động của Enzyme GOx

GOx có thể oxi hóa β-D-glucose sử dụng các chất oxi hóa

khác bên cạnh phân tử oxy, bao gồm các quinine và các chất nhận 1

electron. D-glucono-1,5-lactone sau đó tự động thủy phân để tạo ra

acid gluconic.

C6H12O6 + O2 + H2O C6H12O7 + H2O2

Glucose Acid gluconic

Phản ứng tối ưu ở điều kiện nhiệt độ giữa 30 đến 500

C tại pH

giữa 4,5 đến 6,5.

1.4.3. Ứng dụng của GOx

a. Ứng dụng trong thực phẩm và đồ uống

b. Ứng dụng glucose oxidase trong sản xuất rượu

c. Ứng dụng xác định hàm lượng glucose trong máu

GOx

10

CHƯƠNG 2

QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

2.1. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Hóa chất

2.1.2. Thiết bị nghiên cứu

2.2. TỔNG HỢP NANO SẮT TỪ (Fe3O4NP) BẰNG PHƯƠNG

PHÁP ĐỒNG KẾT TỦA HỖN HỢP MUỐI FeCl2.4H2O và

FeCl3.6H2O

Cho hỗn hợp muối sắt FeCl2.4H2O và FeCl3.6H2O theo tỉ lệ

mol là 1:2 vào bình cầu chứa 50ml nước khử ion. Khuấy hỗn hợp

này bằng máy khuấy từ (tốc độ 1000 vòng/phút) trong vòng 30 phút

và liên tục sục khí Ar để tạo môi trường trơ. Sau đó, cho từ từ từng

giọt dung dịch NH3 vào dung dịch phản ứng cho đến khi pH đạt giá

trị từ 10-11, dung dịch chuyển màu từ cam sang nâu và cuối cùng là

màu đen. Tiếp tục khuấy dung dịch ở 1200

C trong vòng 3 giờ. Các

hạt nano sắt từ thu được sau khi tách ra bằng từ tính và rửa lại nhiều

lần bằng nước cất đến môi trường trung tính.

Quá trình tạo hạt nano từ được biểu diễn theo phương trình

phản ứng sau:

Fe2+ + 2Fe

3+ + 8OH-

→ 2 Fe(OH)3 + Fe(OH)2

2 Fe(OH)3 + Fe(OH)2 → Fe3O4+ 4H2O

Sấy mẫu ở 600

C ta thu được hạt nano sắt từ Fe3O4.

2.3. BIẾN TÍNH BỀ MẶT VẬT LIỆU Fe3O4NP BẰNG

CHITOSAN

Cho chitosan dạng bột được hòa tan trong dung dịch acid

axetic 2% ở nhiệt độ 500

C trong 1 tiếng. Để nguội dung dịch, sau đó,

cho hạt nano oxit sắt đã tổng hợp được và thêm dung dịch